MM_FS_CNJ_0103出口 肉 肉制品 己烯雌酚 残留量 放射免疫法
MM_FS_CNJ_0103
出口肉及肉制品中己烯雌酚残留量检验方法
1.适用范围
本方法适用于出口冻牛肉中己烯雌酚残留量的检验。
2.原理概要
试样中残留的己烯雌酚，用乙醚和氢氧化钠溶液依次提取。氢氧化钠提取液经用正己烷抽去杂质并调整pH后，再用乙醚提取、蒸干，最后用甲醇-磷酸盐明胶缓冲液溶解残渣。加入己烯雌酚氚标记物及抗体，置4℃静置后加分离剂，离心，取上清液，用液体闪烁分析仪进行测定。
3.主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
磷酸盐缓冲溶液：pH7.2，取1.45g磷酸氢二钠(含12个结晶水)、0.1g磷酸二氢钾(无水)，8.0g氯化钠，溶解于水中并定容至1000mL；
磷酸盐-明胶缓冲液：取1.0g明胶用磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释至1000mL；
活性炭：60目；
葡聚糖：G200；
分离剂(活性炭-葡聚糖溶液)：取100mg葡聚糖，溶解于100mL磷酸盐-明胶缓冲液中，然后加1g活性炭，电磁搅拌1h，置于锥形瓶中于4℃保存。临测定前用磷酸盐-明胶缓冲液稀释4倍；
氢氧化钠溶液：0.1mol/L；
无水乙醚；
三氯甲烷；
正己烷；
磷酸溶液：磷酸(85%)＋水(1＋1)；
甲醇-磷酸盐-明胶缓冲液：甲醇＋磷酸盐-明胶缓冲液(1＋4)；
2，5-二苯基口恶唑；
1，4-双〔2′-(4′-甲基-5′-苯基口恶唑)〕-苯；
闪烁液：取4g 2，5-二苯基口恶唑和0.2g 1，4-双〔2′-(4′-甲基-5′-苯基口恶唑)〕-苯，溶于1000mL二甲苯中，充分混匀，置于棕色瓶内，静置3日后使用；
己烯雌酚标准品：纯度≥99%(USA Sigma公司提供或相当者)；
己烯雌酚标准贮备液：准确称取10mg己烯雌酚标准品，置于100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，作为标准贮备液(每毫升含己烯雌酚0.1mg)，密封保存；
己烯雌酚标准工作液：临测定前，精确移取适量的己烯雌酚标准贮备液，用甲醇-磷酸盐-明胶缓冲溶液稀释成浓度为12.5、25、50、100、200、400pg/100μL的标准工作液，用以制备标准曲线；
己烯雌酚抗体(DES-Ab)：每瓶含0.05mL(真空冻干)DES-Ab抗血清(CENTRCdErECE ERrOUSSEL LICCAF制品或相当者)。
己烯雌酚抗体工作液：取己烯雌酚抗体1瓶加入10mL磷酸盐缓冲溶液使其完全溶解，该工作液置4℃保存，有效期7天。
己烯雌酚氚标记物(3H-DES)：英国放化中心Amersham生产，或相当者。放射性浓度为?Mbq/mL。
己烯雌酚氚标记物工作液：取己烯雌酚氚标记物，置固定的试剂瓶中，加入磷酸盐缓冲液稀释至放射性浓度为5 000cpm/100 μL的己烯雌酚氚标记物工作液。
3.2.仪器
液体闪烁分析仪：仪器操作条件是机器运行时，环境温度为15～30℃，相对湿度为30%～80%，确定本仪器地点远离所有的放射源；
绞碎机：电动；
低温离心机：不低于3 500r/min；
水浴锅：恒温温度(40±1)℃；
电磁搅拌器；
微量注射器：50～200μL；
低钾闪烁瓶；
试管：75mm×16mm，带磨口玻璃塞。
4.试样的抽取与制备
4.1.检验批
以不超过2500件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。
4.2.抽样数量
批量，件 | 最低抽样数，件 |
1～25 | 1 |
26～100 | 5 |
101～250 | 10 |
251～500 | 15 |
501～1000 | 17 |
1001～2500 | 20 |
4.3.抽样方法
按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。从每件中至少取一袋作为原始样品。如每件中无小包装或有小包装，但每袋小包装重量超过2kg者，则可用灭菌刀具从每件中割取不少于100g，混合后置于清洁容器内，作为混合原始样品。混合原始样品的总量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。
4.4.试样制备
从混合原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g，均分成两份，装入清洁容器内作为试样，加封并标明标记。
4.5.试样保存
将试样于－18℃以下冷冻保存。
注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
5.过程简述
5.1.提取
称取4g试样(精确至0.1g)，置于试管中，加入10mL无水乙醚振摇20min后，以3500r/min离心3min，将提取液转移至另一干净试管中，重复上述操作一次。合并乙醚提取液，于40℃水浴中蒸发至近干。用4mL三氯甲烷溶解残渣，然后加4mL氢氧化钠溶液振摇2min，静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内，重复上述操作一次。合并氢氧化钠溶液层。加入8mL正己烷，剧烈振摇，待分层后弃去正己烷层。用磷酸溶液调整溶液pH至7.0。每次用8mL无水乙醚提取两次，合并乙醚层并蒸发至近干。用1mL甲醇-磷酸盐-明胶缓冲液溶解残留物，溶液供液体闪烁分析仪测定。
5.2.标准曲线的绘制
取18只试管并编号，按下述操作过程制备。
1号、2号管作为测量总T数用。分别依次加入1200μL磷酸盐-明胶缓冲液和100μL己烯雌酚氚标记物工作液后，于4℃静置12h。
3号、4号管作为测量非特异结合率(NSB)用。分别依次加入700μL磷酸盐-明胶缓冲液和100μL已烯雌酚氚标记物工作液后，于4℃静置12h，加入500μL分离剂。
5号、6号管作为测量特异结合率(B0)用。分别依次加入600μL磷酸盐-明胶缓冲液、100μLdES-Ab抗血清和100μL己烯雌酚氚标记物工作液后，于4℃静置12h，加入500μL分离剂。
7～18号管作为标准溶液用。选12.5、25、50、100、200、400pg/100μL六个浓度标准工作液，每个浓度用两管。分别依次加入500μL磷酸盐-明胶缓冲液、100μL标准溶液、100μLdES-Ab抗体和100μL已烯雌酚氚标记物工作液后，于4℃静置12h，加入500μL分离剂。
以上各管静置30min后以3500r/min离心20min，吸取每管全部上清液，放入闪烁瓶内，加入10mL闪烁液，静置3h后，在液体闪烁分析仪上测定放射性计数。
总T表示标记物在本次实验中的浓度，该浓度应和样液中被测物浓度保持同一水平，如偏离太远，应适当调节试液浓度。
按式(1)计算B/B0值：
B/B0＝ | B－NSB | ×100 | …………………………………(1) |
B0－NSB |
式中：B/B0——结合率，%；
B——标准工作液各浓度双管计数均值；
B0——特异结合双管(即5号、6号管)计数均值；
NSB——非特异结合双管(即3号、4号管)计数均值。
求得B/B0(%)值后，以此为纵坐标，各标准工作液浓度为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。
5.3.样液测定
取2只试管，于每只试管中分别加入500μL磷酸盐-明胶缓冲液，100μL最终样液，100μLdES-Ab抗体及100μL己烯雌酚氚标记物工作液后，于4℃静置12h，加入500μL分离剂，以下操作方法与制作标准曲线相同。根据液体闪烁分析仪测定的数据，求得B/B0(%)值，再从标准曲线上查出样液中己烯雌酚的浓度。
5.4.空白试验
使用经脱激素肉样，按上述测定步骤进行操作。
6.结果计算
按式(2)计算试样中己烯雌酚残留含量：
X＝ | c·V | ……………………………(2) |
m |
式中：X——试样中己烯雌酚残留含量，μg/kg；
c——从标准曲线上查得样液中己烯雌酚浓度，ng/mL；
V——样液最终体积，mL；
m——所称试样量，g。
注：计算结果应扣除空白值。
7.低限、回收率的测定
7.1.测定低限
本方法的测定低限为0.05μg/kg。
7.2.回收率
牛肉中己烯雌酚添加浓度及其回收率的实验数据：
在0.05μg/kg时，回收率为86.4%；
在0.10μg/kg时，回收率为91.7%；
在0.50μg/kg时，回收率为101.2%。
8.来源：
SN 0672—1997