ANNEXINV-FITC标记法细胞凋亡检测试剂盒产品说明书中文版主要用途

ANNEXINV-FITC标记法细胞凋亡检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

ANNEXINV-FITC标记法细胞凋亡检测试剂是一种旨在使用异硫氰酸荧光素标记的膜粘连蛋白-5（AnnexinV），探寻细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻移位，来分析特征性早期细胞凋亡状况的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动物、人体、植物等）的细胞凋亡测定。广泛用于细胞凋亡的研究。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞凋亡，或细胞程序性死亡，在诸如形态发育、免疫系统调节、以及肿瘤和神经退行性疾病等各种生物学过程中，起着实质性的作用。凋亡细胞具有形态、生化、和分子方面的显著特征。抗凝血蛋白膜粘连蛋白-5（AnnexinV）是35至36kd的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，主要与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine；PS）可逆性结合，每个分子AnnexinV结合50个单体磷脂酰丝氨酸。在正常生理状态下，磷脂酰丝氨酸，是四种主要细胞膜磷脂成分之一，和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine；PE）一起分布在细胞质膜的内侧，即面向胞浆的一面。一旦细胞凋亡启动，细胞膜失去了磷脂双层的非对称性分布和完整性，导致磷脂酰丝氨酸移位到细胞膜外侧，成为巨噬细胞的识别目标，由此细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸可以通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记的AnnexinV进行探测。伴随碘化丙啶（Propidiumiodide；PI）的染色以区别晚期细胞凋亡。碘化丙啶为膜非通透性染料，受到活细胞排外，如果细胞处于晚期凋亡或死亡，则呈现红色荧光的细胞核。借助细胞流式仪，可以清晰探测细胞凋亡的程度。流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）是七十年代发展起来的集计算机、激光、流体力学、细胞化学、细胞免疫学为一体的高科学技术。

产品内容

清理液（ReagentA） 25毫升反应液（ReagentB） 5毫升染色液（ReagentC） 50微升复染液（ReagentD） 50微升产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（ReagentC）和复染液（ReagentD）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰

箱里，避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的处理15毫升锥形离心管：用于细胞收集的操作
1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

台式离心机：用于细胞收集的操作
微型台式离心机：用于细胞收集的操作
荧光显微镜：用于细胞荧光观察
细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20冰箱里的试剂置于室温下冻融。移取100微升反应液（ReagentB）到1.5毫升离心管，然后分别加入5微升染色液（ReagentC）和复染液（ReagentD），混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里，放进暗室里备用。然后进行下列操作。

一、直接法

1．准备1个细胞培养6孔板，内置1个细胞1X 1 cm大小的载玻片
2．接种待测细胞培养，直至每孔铺满率达70％
3．小心抽去细胞培养液
4．轻轻加上500微升清理液（ReagentA）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
5．小心抽去清理液（ReagentA）
6．小心加上100微升染色工作液，覆盖样品表面
7．在暗室里室温下孵育15分钟
8．小心抽去染色工作液
9．轻轻加上200微升反应液（ReagentC）到细胞载玻片上，覆盖样品表面
10．小心抽去反应液（ReagentC）
11．重复实验步骤9和10一次
12．封片
13．即刻在荧光显微镜下进行观察（每个视野计数200个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（细 胞膜染色）或620nm（细胞核染色）――
正常细胞――绿色和红色荧光均为阴性
早期细胞凋亡阳性细胞――绿色荧光阳性，红色荧光阴性
晚期细胞凋亡阳性细胞――绿色和红色荧光均为阳性

二、间接法

1．准备1个25cm2细胞培养瓶的待测细胞，直至铺满率达70％（约100万细胞数）2．小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）
3．加入2毫升清理液（ReagentA），覆盖细胞表面
4．小心移出2毫升清理液（ReagentA）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）5．加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满细胞表面
6．放进37℃培养箱孵育1分种
7．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
8．加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
9．移入到15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞可以由此步开始）

10．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
11．小心抽去上清液
12．加入500微升清理液（ReagentA），混匀
13．转入到1.5毫升离心管
14．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF15）
15．小心抽去上清液
16．加入100微升染色工作液
17．用200微升头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群
18．在暗室里室温下孵育15分钟
19．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF15）
20．小心抽去上清液
21．加入200微升反应液（ReagentB），混匀
22．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF15）
23．小心抽去上清液
24．加入200微升反应液（ReagentB），混匀
25．即刻移取10微升在载玻片上压片
26．在荧光显微镜下进行观察（每个视野计数200个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（细胞膜 染色）或620nm（细胞核染色）
27．或即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm氩离子激光器，观察50000个细胞以上
28．建立地形图或散点图以及直方图分析如下

注意事项

1．本产品为10次操作
2．在整个操作过程中须戴手套，以防污染
3．确保实验准确性，须收集所有悬浮和贴壁细胞

4．避免使用EDTA、EGTA等钙离子螯合剂处理样品，否则将干扰检测5．孵育时，必须避免光照
6．建议检测细胞量达106细胞数为佳
7．用户可以根据情况，适度调整试剂用量
8．建议细胞染色完成后，即刻进行荧光分析，不宜超过1小时
9．细胞流式仪分析前，须混匀内容物
10．细胞检测量不得少于10000个
11．务必测试正常对照组
12．检测时，须弥补电子补偿，以去除双重参数的光谱重叠
13．正常样品会呈现少量凋亡和死亡细胞，作为检测本底
14．可以使用细胞凋亡诱导剂喜树碱（Camptothecin）作为阳性对照15．告知流式仪技术员有关细胞类型
16．本公司提供系列细胞凋亡检测试剂产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定显色清晰