腹水型单克隆抗体纯化方法的研究

肖增鸿;黄昭亮;林月霞;董斌;田素娟

【摘 要】目的：比较不同纯化方法对腹水型抗体的纯化效果，探索出最适合实验室抗体生产的纯化方法。方法制备的 IgG1单克隆抗体腹水（4-D10）分别利用两步硫酸铵沉淀法（AS 法）、辛酸-硫酸铵沉淀法（CA-AS法）、辛酸-硫酸铵沉淀法联合 DEAE 阴离子交换层析法与辛酸-硫酸铵沉淀法联合蛋白 G 亲和层析法纯化处理后，经蛋白纯度、回收率、抗体免疫活性鉴定分析后，比较不同的纯化方法对腹水型抗体的纯化效果。结果① AS 法的蛋白纯度为25%，低于 CA-AS 法

（44%）；AS 法回收率为63%，高于 CA-AS 法（41.8%）；比较抗体效价表明，AS 法（1.024×106）与 CA-AS 法（1.024×106）两者相当。②粗提后纯化效果表明，蛋白 G亲和层析法回收率明显降低，DEAE 纯品虽纯度略低，但回收率较高，且效价（5.12×105）高于蛋白 G 亲和层析法（1.28×105）。结论 CA-AS 联合 DEAE 离子交换法是适合实验室生产单抗的低成本、纯化效果和回收效果较佳的方法。%Objective To compare different methods for purification of antibodies from mouse ascites fluid in order to explore the most suitable laboratory method for purifying antibody. Methods Ammonium sulfate precipitation (AS) and caprylic acid-ammonium sulfate precipitation (CA-AS) methods were used for purification of crude IgG1 antibodies, respectively. The crude samples were further purified by protein G chromatography and DEAE ion exchange chromatography, respectively. Results The purity of antibody purified by AS method was 25%, lower than that of 44%purified by CA-AS method. The antibody recovery by AS method was 63%, higher than that of the CA-AS method 41.8%. The

antibody titers obtained by AS method and CA-AS method were almost the same, 1.024 × 106. Further antibody purification by protein G

chromatography and DEAE chromatography were performed. The recovery of antibody by protein G chromatography was lower than that by DEAE chromatography. Conclusion CA-AS combined with DEAE chromatography method is the most suitable method for the small scale purification of monoclonal antibody from mouse ascites fluid due to its better recovery, higher purity and lower cost. 【期刊名称】《中国医药生物技术》 【年(卷),期】2013(000)006 【总页数】4页(P425-428)

【关键词】抗体,单克隆;分步沉淀;色谱法;离子交换 【作 者】肖增鸿;黄昭亮;林月霞;董斌;田素娟

【作者单位】510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院;510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院;510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院;510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院;510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院 【正文语种】中 文

单克隆抗体被广泛应用于免疫学、药理学、细胞生物学、微生物学、临床疾病的预防、诊断和治疗及畜牧产品违禁限制药物的检测等。其生产方式主要有小鼠体内诱

生腹水和杂交瘤细胞体外培养；前者生产成本低，是目前用于体外应用的主要生产方式。但无论哪种方式生产的单抗，均含有大量的杂蛋白，主要包括白蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、α-巨球蛋白、脂类蛋白以及其他宿主蛋白等，不能直接应用于体外。因此需对单抗进行后续的纯化，以达到使用要求。但目前尚没有一种方法能满足不同目的需要，尤其是在规模化制备单克隆抗体问题上显得更为突出。为了在大规模单克隆抗体的制备过程中，尽量减少经济成本与时间成本，对腹水型单抗纯化工艺进行了探讨[1-2]。 1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂

全自动数码凝胶图像分析系统、垂直电泳仪由上海天能科技有限公司生产；Moderl 680 酶标仪为美国 Bio-Rad 公司产品；Ultrospec1100pro 紫外可见分光光度计为美国 Amersham Biosciences 公司产品；核酸蛋白检测仪为上海青浦沪西仪器厂产品；小型台式记录仪购自上海自动化仪表三厂；蛋白 G 亲和层析柱和 DEAE 阴离子层析柱为美国GE 公司产品；Sephadex G-25 由美国 Pharmacia公司生产；4-D10 抗氯霉素单抗（IgG1）腹水由本实验室制备；辣根过氧化物标记羊抗鼠 IgG 由精美公司分装；牛血清白蛋白 BSA 由瑞士 Roche公司分装；硫酸铵、正辛酸等为国产化学试剂。 1.2 方法

1.2.1 腹水预处理 –20 ℃ 保存的原腹水置于4 ℃ 解冻过夜，取出后 4 ℃ 条件下，10000×g 离心 10 min，取上清，4 ℃ 保存。

1.2.2 两步硫酸铵沉淀法（AS 法） 取预处理腹水，用 0.02 mol/L pH 7.2 的磷酸盐缓冲液（PB）稀释 3 倍，再逐滴加入等量 pH 7.0 饱和(NH4)2SO4 溶液，使其饱和度达到 50%，边加边搅拌，充分混匀后冰面静置 30 min。4 ℃ 条件下，10000×g 离心 10 min，取上清，将沉淀于 2 倍原腹水体积的 PB 复溶，再逐滴

加入 8 倍原腹水体积 pH 7.0 饱和硫酸铵，使其饱和度达到 33%，充分混匀后冰面静置 30 min。4 ℃，10000×g 离心 10 min。弃上清，将沉淀 4 ℃ 保存。 1.2.3 辛酸-硫酸铵沉淀法（CA-AS 法） 取预处理腹水，用 0.06 mol/L pH 4.4 醋酸缓冲液稀释3 倍，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 4.8；按每毫升稀释腹水加 11 μl 辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于 30 min 内加完，4 ℃ 静置 2 h。取出后，4 ℃ 条件下，15000×g 离心 30 min，取上清，加入 1/10 体积的 0.01 mol/L PBS，用 1 mol/L NaOH 调 pH 至 7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至 45% 饱和度，静置 30 min。取出后，10000×g离心 30 min，弃上清，将沉淀 4 ℃ 保存。

表1 不同方法纯化后蛋白浓度比较Table1 Comparison of purified protein concentrations by different methods纯化前蛋白浓度(mg/ml)Original protein concentration (mg/ml)纯化后蛋白浓度(mg/ml)Purified protein concentration (mg/ml)原腹水Ascites AS 沉淀法Ammonium sulfate precipitation CA-AS 沉淀法Caprylic acid-ammonium sulfate precipitation蛋白 G 法Protein G chromatography DEAE 法DEAE-chromatography 38.3 14.93 9.06 2.65 4.63

1.2.4 蛋白 G 亲和层析法 将辛酸-硫酸铵法获得的沉淀以 0.02 mol/L pH 7.0 PB 溶液重溶，过蛋白 G 亲和柱。以 0.1 mol/L pH 2.7 Gly-HCl 为洗脱缓冲液，流速 1 ml/min 洗脱，以 1.0 mol/L pH 9.0 Tris-HCl 为中和缓冲液进行接样收集蛋白。提纯样品保存在 –20 ℃。

1.2.5 DEAE 离子交换层析 将辛酸-硫酸铵法获得的沉淀以 0.01 mol/L pH 7.2 PB 溶液 A 重溶，经 Sepharose G-25 除盐后，过 DEAE 阴离子层析柱。以含 0.5 mol/L NaCl 的 0.01 mol/L pH 7.2 PB 为洗脱液 B，A、B 液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰。提纯样品保存于 –20 ℃ 环境中。

1.2.6 蛋白浓度鉴定 采用紫外分光光度计对抗体进行检测。测定前用溶解抗体的 PB 溶液调零，分别测定 3～4 个数值，取其平均值。利用公式：蛋白含量(mg/ml) =（1.45×OD280–0.74×OD260）× 稀释倍数。

1.2.7 蛋白分子量鉴定 以还原型 SDS-PAGE进行分析，具体方法参照文献[1]，分离胶浓度为10%。

1.2.8 蛋白纯度鉴定 以非还原型 SDS-PAGE进行分析，具体方法参照文献[1]，分离胶浓度为7.5%。

1.2.9 抗体免疫活性鉴定 采用间接 ELISA 法检测纯化后抗体效价。以合适浓度的包被抗原CAP-OVA 包被酶标板。根据蛋白浓度检测结果及SDS-PAGE 鉴定的纯度不同，对样品进行适当稀释，使纯化后 IgG 浓度与原腹水浓度相同。以原腹水按照 1∶1000 稀释液为阳性对照，SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞 1∶1000 稀释腹水为阴性对照。具体操作方法参照文献[2]。 2 结果

2.1 单克隆抗体分子量与纯度、浓度鉴定

2.1.1 纯化前后抗体浓度测定 不同方法腹水纯化前后的蛋白含量见表 1，由此可以看出不同纯化方法的收率。

2.1.2 单克隆抗体分子量鉴定 IgG 抗体在 2-巯基乙醇作用下，免疫球蛋白中的二硫键被破坏，重链与轻链分开，因此，在还原型 SDS-PAGE 电泳中，可见两条明显的条带，两者分子量分别为：重链约 50 kD，轻链约 28 kD，如图 1 所示。单克隆抗体的分子量为 156 kD。

图1 单克隆抗体还原型 SDS-PAGE 电泳Figure1 Reduced SDS-PAGE

electrophoresis of antibody1：原腹水；2：蛋白分子量标记；3、4：蛋白 G 亲和层析纯品1: Original ascites; 2: Protein marker; 3, 4: Antibodies purified by protein G chromatography

2.1.3 单克隆抗体纯度鉴定 由于 IgG 抗体由轻链与重链组成，还原型 SDS-PAGE 电泳很难直观分析其纯度，如图 2 所示，只能粗略观察到，CA-AS 法纯化后腹水纯度略大于两步 AS 法纯化后腹水。利用凝胶成像系统进行分析，CA-AS 法纯化后单抗纯度可达 44%，而两步 AS 法则只能去除含量较大的大分子蛋白条带，纯度约为 25%。

图2 粗提腹水还原型 SDS-PAGE 电泳Figure2 Reduced SDS-PAGE

electrophoresis of the crude sample1：蛋白分子量标记；2：原腹水；3：两步 AS 法纯化后腹水；4：CA-AS法纯化后腹水1: Protein marker; 2: Original ascites; 3: Ascites purified by two-step AS method; 4: Ascites purified by CA-AS method

为了进一步比较单抗纯化的效果，采用非还原型 SDS-PAGE 电泳检测了抗体的纯度。SDS-PAGE电泳分离胶浓度为 7.5%，然后借助电泳条带分析软件进行分析，从而精确判断抗体的纯度。利用凝胶成像系统进行分析，可得：蛋白 G 亲和层析纯化样品为单一条带，DEAE 离子交换层析纯化样品还有一些未知大分子残留，纯度 87%（图 3）。

2.2 单克隆抗体纯度、回收率

通过凝胶成像系统进行分析，对分析结果进行计算，可得到各种纯化方法纯化后的 IgG 纯度及相应的回收率，如表 2 所示。AS 法回收率最高，达到 63%，但其纯度明显低于 CA-AS 法；蛋白 G亲和层析法纯度达到 100%，但其回收率小于10%；DEAE 回收率 11.7%，明显高于蛋白 G 亲和层析法 6.9%，纯度 87%。 2.3 纯化后抗体间接 ELISA 效价检测

纯化后抗体效价如表 2 所示。将纯化前后腹水调节至相同浓度，通过有限稀释法设定检测梯度，以 OD630 为参照，测定 OD450，以 P/N ≥ 2.1临界值为最高稀释倍数，即相应效价。结果表明：原腹水效价为 2.048×106，AS 法和 CA-AS 法

纯化后抗体活性略低于原腹水；蛋白 G 法纯化后效价为 1.28×105，低于 DEAE 法，抗体活性损失较DEAE 法大。

图3 非还原型 SDS-PAGE 电泳测定单克隆抗体纯品纯度Figure3 SDS-PAGE electrophoresis of samples1：蛋白分子量标记；2：原腹水；3：蛋白 G 亲和层析纯品；4：原腹水；5：DEAE 离子交换层析纯品1: Protein marker; 2: Original ascites; 3: Antibody purified by protein G chromatography; 4: Original ascites; 5: Antibody purified DEAE-chromatography 3 讨论

单克隆抗体在生物检测和医学、畜牧领域的应用越来越广泛，而其纯度与活性是影响其质量的关键因素。当前实验室常用的小鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b 类单克隆抗体纯化方法中，常用沉淀法和层析法。常用粗纯的沉淀法有 AS 法、CA-AS 法，一般回收率高，但纯度低，活性较好，其中 AS 法收率较高，CA-AS 法纯度较高、抗体活性好[2-4]。而经 AS 法或 CA-AS 法初步纯化再联合 DEAE阴离子交换层析法或蛋白 A、G 亲和层析进一步纯化，纯度可达 87%～100%[2, 5-6]，但回收率较低，CA-AS 法联合蛋白 A 亲和层析法回收率为26%[5]，AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法回收率为 8.9%[2]。本研究分别探讨了 AS 法、CA-AS法、CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法与CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法纯化抗氯霉素的 IgG1 类单克隆抗体，AS 法、CA-AS 法的回收率与周玉等[2]、梁荣等[4]的结果一致，但抗体纯度、活性降低，还有待进一步研究。CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法纯化，纯度高，但回收率、活性低，成本高。采用 CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法，纯度比 CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法稍低，但显著提高了回收率与活性，比周玉等[2]报道的回收率 8.9% 有所提高。综合考虑，CA-AS 法联合 DEAE 阴离子交换层析法，与 AS法、CA-AS 法及 CA-AS 法联合蛋白 G 亲和层析法相比，无论在抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，

且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低，在实验室检测试剂盒制备方面，利用此方法纯化单克隆抗体，有一定的应用价值。

表2 不同纯化方法纯化后蛋白纯度、回收率与效价Table2 Comparison of purity, recovery and antibody titer by different purification methods项目Items AS 法Ammonium sulfate precipitation CA-AS 法Caprylic acid-ammonium sulfate precipitation蛋白 G 法Protein G chromatography DEAE 法DEAE- chromatography纯度(%) Purity (%) 25.1 44.2 100 87回收率(%) Recovery (%) 63 41.8 6.9 11.7效价 Titer 1.024×106 1.024×106 1.28×105 5.12×105 参考文献

【相关文献】

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