维普资讯 http://www.cqvip.com 中华老年心脑血管病杂志２００８年１０月第ｌＯ卷第ｌ０期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｈｅａｒｔ Ｂｒａｉｎ Ｖｅｓｓｅｌ Ｄｉｓ，Ｏｃｔ ２００８，Ｖｏｌ １０，Ｎｏ．１０ ．认知功能障碍研究 Ｎ一甲基一Ｄ一天冬氨酸受体和突触后致密物质９５ 在血管性痴呆大鼠中作用机制的研究 何雨，金玉芬，张昱 摘要：目的 观察血管性痴呆（ＶａＤ）大鼠Ｎ一甲基一 天冬氨酸一２Ｂ亚基受体（ＮＲ２Ｂ）和突触后致密物质９５（ＰＳ￣９５） 在ＶａＤ发生、发展中的作用。方法 采用永久性结扎双侧颈总动脉方法将９６只Ｗｉｓｔａｒ大鼠随机分为假手术组 （３２只）、ＶａＤ模型组（模型组，３２只）和美金刚治疗组（治疗组，３２只）。用免疫组织化学法检测术后４、８、１２、１６周 大鼠海马ＮＲ２Ｂ和ＰＳＤ９５的表达，并同时采用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试大鼠的学习记忆水平。结果 随着缺血时间的 延长，与假手术组｝匕较，模型组大鼠术后４、８、１２、１６周学习记忆能力下降，差异显著（Ｐ＜０．０１）；术后４周时ＮＲ２Ｂ 和ＰＳＤ－９５的表达明显高于假手术组（Ｐｄ０．０１），此后逐渐减少，显著低于假手术组（Ｐ＜０．０１），术后１６周时表达 最少。治疗组大鼠术后４周时学习记忆水平及ＮＲ２Ｂ、ＰＳ￣９５的表达与假手术组比较无显著差异，术后８、ｌ２、１６ 周时，上述指标较模型组显著好转但仍差于假手术组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。结论 大鼠海马ＮＲ２Ｂ和ＰＳＩ）＿９５作 为复合体参与ＶａＤ的形成和发展，适量的美金刚通过调节ＮＲ２Ｂ的表达进而改善ＶａＤ大鼠的认知功能。 关键词：痴呆，血管性；受体，Ｎ一甲基一【）Ｉ天冬氨酸；突触；记忆；海马；突触后致密物质９５ 中图分类号：Ｒ７４９．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－０ｌ２６（２００８）１０—０７３１－０３ Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ０ｆ ＮＲ２Ｂ／ＰＳＤ一９５ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｒａｔｓ ＨＥ Ｙｕ，ＪＩＮ Ｙｕ—ｆｅｎ，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ （Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００４１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎ—ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ—ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２Ｂ（ＮＲ２Ｂ）ａｎｄ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ９５（ＰＳＤ一９５）ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＶａＤ）ｏｆ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ＶａＤ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ． Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｔｗｅｎｔｙ—ｅｉｇｈｔ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ，ＶａＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｅｍａｎｔｉｎｅ—ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＲ２Ｂ ａｎｄ ＰＳＤ－９５ ｉｎ ｈｉｐｐｏ— ｃａｍｐｕｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｏｆ ＶａＤ ｒａｔｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｓ（Ｐ ｄ０．０１）． ＮＲ２Ｂ ａｎｄ ＰＳＤ一９５ ｈａｄ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＶａＤ ｒａｔｓ，ｗｈｉｃｈ ｆｉｒｓｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ（Ｐ＜ ０．０１），ｔｈｅｎ ｆｅｌｌ ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ ｄ０．０１）． Ｉｎ ｍｅｍａｎｔｉｎｅ—ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ，ａｔ ４ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｒａｔｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＲ２Ｂ ａｎｄ ＰＳＤ－９ ５ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｔ ８，１ ２，１ ６ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｎｄｅｘｅｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ ｗｅｒｅ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ＶａＤ ｒａｔｓ ａｎｄ ｓｔｉｌｌ ｗｏｒｓｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＮＲ２Ｂ ａｎｄ ＰＳＤ－９５ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＶａＤ ａｎｄ ｍｅｍａｎ— ｔｉｎｅ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＲ２Ｂ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｄｅｍｅｎｔｉａ，ｖａｓｃｕ［ａｒ；ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｎ—ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ；ｓｙｎａｐｓｅｓ；ｍｅｍｏｒｙ；ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ； ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ９５ Ｎ一甲基一Ｄ一天冬氨酸受体（ＮＭＤＡＲ）与长时程 突触增强、学习记忆、神经系统生长发育的可塑性、 缺血缺氧损伤及老年性痴呆等神经退行性疾病有密 作者单位：１３００４１长春，吉林大学第二医院（何雨，金玉芬）；吉林大 切关系。突触后致密物质９５（ＰＳＤ一９５）是ＮＭＤＡＲ 学第一医院（张昱） 的主要结合位点，调节ＮＭＤＡＲ的功能及其下游特 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华老年心脑血管病杂志２００８年１０月第１０卷第ｌ（）期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｈｅａｒｔ Ｂｒａｉｎ Ｖｅｓｓｅｌ Ｄｉｓ，（ｋ－ｔ ２００ ８，Ｖｏｌ ｌ０，Ｎｏ．１０ 异性信号转导通路的激活。因此，研究血管性痴呆 （ＶａＤ）中ＮＭＤＡＲ与ＰＳＤ一９５的表达变化，有助于 了解它们所引导的信号转导通路的变化，为ＶａＤ的 ２ 结 果 ２．１ ３组大鼠行为学检测比较与似手术组比较， 治疗寻求方法和依据。 １材料与方法 模型组大鼠术后４、８、１２、ｌ６周搜索持续时间明显延 长，跨越平台次数减少（Ｐ＜０．０１），治疗组术后４ 周时水迷宫成绩无差异，其他３个时间点均有显著 雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠９６只（吉 差异（Ｐ＜０．０１）；与模型组比较，各治疗时间点均 有明显改善（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，表１，２）。 １．１ 实验动物及分组林大学医学动物中心提供）．体重２８０～３００ ｇ，随机 分为假手术组（３２只）、ＶａＤ模型组（模型组，３２ 只）、美金刚治疗组（治疗组，３２只）。各组于术后４、 ８、１２和１６周分别处死８只大鼠。治疗组在喂养的 最后４周给予美金刚（广东肇庆星湖生物科技股份 有限公司）１０ ｍｇ・ｋｇ～ ・ｄ 灌胃ｕ Ｊ。 １．２ ＶａＤ动物模型制备 大鼠术前１２ ｈ禁食，４ ｈ 禁水。用１０ 水合氯醛（３ ｍｌ／ｋｇ）腹腔注射麻醉， 保证手术期间有自主呼吸。双侧颈总动脉永久性结 扎建立ＶａＤ大鼠模型。假手术组大鼠不结扎颈总 动脉。 １．３ 行为学检测 采用中国医学科学院生产的 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫，以搜索持续时间（逃避潜伏期）和跨 越平台次数作为衡量大鼠记忆功能的标准，所有大 鼠术前均行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试，确定各大鼠无明显 智能差异，符合标准。 １．４取材、切片 各组大鼠分别于相应的时问点深 度麻醉下开胸，分别用４℃生理盐水（２００ ｍｌ／鼠）、 ４℃４ 多聚甲醛（５００ ｍｌ 鼠，ＰＢＳ配制．ｐＨ７．４）经 左心室冲洗和灌注固定，灌毕取脑，４℃后固定过 夜。常规乙醇脱水。二甲苯透明，浸蜡包埋，连续切 片，厚度为５／ｚｍ。采用免疫组织化学染色方法。 １．５ ＮＭＤＡＲ－２Ｂ亚基受体（ＮＲ２Ｂ）和ＰＳＤ－９５免疫 组织化学染色及图像分析 采用ＳＰ染色法检测 ＮＲ２Ｂ和ＰＳＤ一９５的表达．一抗兔抗大鼠ＮＲ２Ｂ抗 体（北京博奥森公司，效价１：１００），小鼠抗大鼠 ＰＳＤ～９５单克隆抗体（效价１：３００，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ公司）； 二抗羊抗兔ＩｇＧ、二抗羊抗小鼠ＩｇＧ（福州迈新生物 技术有限公司，效价１：１０００）。用ＰＢＳ代替一抗做 阴性对照。按ＳＰ免疫组织化学试剂盒说明书操 作，ＤＡＢ显色系统闭光显色后在１０×４Ｏ光镜下观 察每组大鼠海马区，每只大鼠相同部位连续取１Ｏ 张片子，分别选择５个不同视野进行观察，测阳性 细胞数，所得数据计算其均值，再计算每组平均值。 １．６统计学方法采用ＳＰＳＳ １３．０软件，计量资料 用 ± 表示，各组间样本均数行方差分析及 检 验，Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。 表１ ３组大鼠术后逃避潜伏期成绩比较（ ± ，Ｓ） 注：与假手术组比较． Ｐ＜Ｏ．０１；与模型组比较， Ｐ＜Ｏ．０１ 表２ ３组大鼠术后水迷宫跨越平台次数 成绩比较（ｘ± ，次） 注：与假手术组比较． Ｐ＜０．０ｌ；与模型组比较， Ｐ＜（）．０５ Ｐ＜０．０１ ２．２ ３组大鼠海马ＮＲ２Ｂ阳性细胞数比较 与假 手术组比较，模型组术后４周ＮＲ２Ｂ阳性细胞明显 增加，此后逐渐下降，均有显著差异（Ｐ＜０．０１）。 治疗组ＮＲ２Ｂ阳性细胞数术后４周无差异，其他３ 个时间点显著下降（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜ｏ．０１）；与模型 组比较，术后４周明显降低（Ｐ＜Ｏ．０１）．其他３个 时间点显著增加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜Ｏ．０１，表３）。 表３ ３组大鼠ＮＲ２Ｂ阳性细胞数比较（ －－＋－ ，个／ＨＰ） 注：与假手术组比较， Ｐ＜Ｏ．０５。 Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ；与模型组比较 Ｐ＜ｏ．０５． Ｐ＜ｏ．０１ 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华老年心脑血管病杂志２００８年ｌＯ月第ｌＯ卷第ｌ０期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｈｅａｒｔ Ｂｒａｉｎ Ｖｅｓｓｅｌ Ｄｉｓ，Ｏｃｔ ２００８，Ｖｏｌ １０，Ｎｏ．１０ ２．３ ３组大鼠海马ＰＳＤ－９５阳性细胞数比较 与假 手术组比较，模型组术后４周的阳性细胞明显增加， 导的神经毒信号；在缺血晚期，ＰＳＤ－９５减少， ＮＭＤＡＲ于学习记忆的传导通路上的功能变弱，从 而导致ＶａＤ的发生。本研究应用ＮＭＤＡＲ拮抗剂 美金刚对部分ＶａＤ大鼠进行治疗干预。因为 此后显著下降（Ｐ＜０．０１）。治疗组术后４周阳性 细胞数无差异，其他３个时间点明显减低（Ｐ＜ ０．０１）；与模型组比较，治疗组术后４周的阳性细胞 ＮＭＤＡＲ在学习记忆和兴奋毒之间具有双向作用， 数明显下降（Ｐ＜Ｏ．０１），其他３个时间点均显著增 加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜Ｏ．０１，表４）。 表４ ３组大鼠ＰＳＤ－９５阳性细胞数比较（ ± ，个／ＨＰ） 注：与假手术组比较， Ｐｄ０．Ｏ１；与模型组比较， Ｐｄ０．０５ ｃＰ＜０．０１ ３讨 论 ＰＳＤ一９５是兴奋性突触的突触后致密物中重要 的锚蛋白之一，与ＮＲ２Ｂ结合最为紧密。ＮＲ２Ｂ影 响ＮＭＤＡＲ的结构和功能，是最重要的调节亚单位 结构，也是脑缺血引起神经元兴奋性损伤的最主要 成分，与学习记忆关系最为密切【 ］，成年大鼠 ＮＲ２Ｂ在海马分布最多，其次是大脑皮质。ＰＳＤ一９５ 通过与ＮＭＤＡＲ相互作用，把其偶联在突触可塑性 及学习、记忆的调控通路上。然而，缺血缺氧时，抑 制ＰＳＤ一９５的表达或ＰＳＤ－９５与ＮＭＤＡＲ的结合则 对兴奋性毒性和缺血性脑损伤有保护作用。 本研究借助双侧颈总动脉永久性结扎建立 ＶａＤ模型，探讨其在ＶａＤ的发生发展过程中ＮＲ２Ｂ 和ＰＳＤ一９５的变化，发现两者呈现非常类似的双相 表达改变，即随缺血时间的延长，ＮＲ２Ｂ和ＰＳＤ一９５ 阳性细胞数显示出先升后降的变化规律，模型组术 后４周时明显高于假手术组，此后则明显下降。与 ＮＲ２Ｂ和ＰＳＤ一９５的双相变化不同，Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫 测试表明ＶａＤ大鼠的智能水平呈明显的渐进性下 降。术后４周时，ＮＭＤＡＲ还处于过度激活状态， 伴随的钙超载、自由基损伤等引起此阶段学习记忆 能力下降。此后继发的细胞脱失使表达ＮＭＤＡＲ 的神经元减少，难以完成介导学习记忆的生理功能。 而ＰＳＤ一９５具有整合ＮＭＤＡＲ突触信号的功能，在 缺血早期，其过度增加、传递了ＮＭＤＡＲ过表达介 而美金刚是一种低亲和力、非竞争性ＮＭＤＡＲ拮抗 剂，它的亲和力大小适当，在生理活动时能快速从离 子通道解离，而在缺血、缺氧时不解离，并还有部分 离子通道保留给未受影响的谷氨酸递质用于生理性 传导，故副作用较小。尽管开始给药的时间不同，但 治疗组的水迷宫成绩、病理改变及ＮＲ２Ｂ的表达都 较模型组有明显改善，尤其在手术同时给药时，上述 指标与假手术组无显著差异，说明美金刚对ＮＲ２Ｂ 的表达有调节作用，它通过拮抗或上调ＮＲ２Ｂ的量 来削弱其负面影响、加强其生理功能，从而证实了它 自身在ＶａＤ治疗中的应用价值。同时，我们还发现 ＰＳＤ－９５再次呈现与ＮＲ２Ｂ极相似的变化趋势，即避 免缺血早期的表达增加，阻止缺血晚期的表达减少。 由此提示，尽管ＮＭＤＡＲ介导的神经毒性损伤还包 括其他不依赖于ＰＳＤ－９５的信号途径，但是研究结 果证实ＰＳＤ一９５是ＮＭＤＡＲ依赖的兴奋毒性损伤中 起关键作用的元素。Ｃｕｉ等 也指出，抑制ＰＳＤ－９５ 的过表达，可以降低神经细胞对ＮＭＤＡＲ介导的神 经兴奋毒性作用的易感性。因此，双侧颈总动脉永 久性结扎带来的应激影响，引起ＮＭＤＡＲ与ＰＳＤ－ ９５作为一个复合体共同发生变化，并继发其下游传 导网络的改变，其结果是神经元缺血性坏死和学习 记忆的障碍。 参考文献 ［１］苗明三．实验动物和动物实验技术．北京：中国中医药出版社， １９９７．１４２—１４５． ［２］徐春红．曹红．ＮＭＤＡ受体在脑缺血中的作用和机制的研究进 展．国际麻醉学与复苏杂志，２００７，２８：８８—９１． Ｅ３３ Ｃｌａｙｔｏｎ ＤＡ，Ｍｅｓｅｈｅｓ ＭＨ，Ａｌｖａｒｅｚ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ａ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ＮＲ２Ｂ ｄｅｆｉｃｉｔ ｃａｎ ｍｉｍｉｃ ａｇｅ—‘ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｌｏｎｇ—－ｔｅｒｍ ｐｏ—— ｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｓｃｈｅｒ ３４４ ｒａｔ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓ— ｃｉ，２００２，２２：３６２８—３６３７． Ｅ４］Ｃｕｉ Ｈ，Ｈａｙａｓｈｉ Ａ，Ｓｕｎ ＨＳ，ｅｔ ａ１．ＰＤＺ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｎ— ｄｅｒｌｙｉｎｇ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ——ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏ— ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＳＤ－９５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００７，２７：９９０１— ９９１５． （收稿１３期：２００８—０２ ２６） （本文编辑：唐丽君）
