维普资讯 http://www.cqvip.com 中南大学学报（医学版） Ｊ Ｃｅｎｔ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ ｓｃｉ） ｌ７９ 头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林 葡萄球菌异质性耐药菌株的评价 陈 颖，周建党，郭建军，许 薇 （中南大学湘雅三医院检验科，长沙４１００１ ３） ［摘要］ 目的：评价头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌异质性耐药菌株的可靠性和临床实 用性。方法：将临床分离得到的葡萄球菌３ １０株，按美国临床实验室标准化委员会（ＮＣＣＬＳ）标准操作规 程进行苯唑西林纸片扩散法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法实验，并以ＰＣＲ检测葡萄球茵 ｍｅｃＡ基因为判断标准，比较４种方法的敏感性及特异性。结果：经ｍｅｃＡ基因检测，耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌（ＭＲＳＡ）为５７．１％（１ｌ ３／１９８），耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）为６２．５％（７０／ ｌｌ２）。头孢西丁纸片扩散法检测ＭＲＳＡ的敏感性和特异性均为１００％，检测ＭＲＣＮＳ敏感性为９８．６％， 特异性为１００％。结论：头孢西丁纸片扩散法操作简便，结果可靠，可作为临床实验室检测耐甲氧西林 葡萄球菌的常规方法。 【关键词】 头孢西丁纸片扩散法； 耐甲氧西林葡萄球茵； 异质性耐药 ［中图分类号］ Ｑ９３－３３２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７２－７３４７（２００７）０１．０１７９．０４ Ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＳ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｒｕｇ・ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｊｉａｎ—ｄａｎｇ，ＧＵＯ Ｊｉａｎ—ｊｕｎ，ＸＵ Ｗｅｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｘｉａｎｇｙａ Ｈｏｓｐｉｔｌａ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１Ｏ０１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＭＲＳ）ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｒｅｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｔｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃ— ｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｘａｃｉｌｌｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ．ｔｈｅ ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｏｘａｃｉｌｌｉｎ ａｇａｒ ｄｉ— ｌｕｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ ＮＣＣＬＳ．ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｃＡ ｇｅｎｅ ｏｆ ｓｔａｐｈ） ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ，ａ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｃＡ ｇｅｎｅ，ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ ＭＲＳＡ ｗａｓ ５７．１％（１ １３／１９８） ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ ＭＲＣＮＳ ｗａｓ ６２．５％（７０／ｌｌ２）．Ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＳ ｗｅｒｅ １ Ｏ０％．ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＣＮＳ ｗｅｒｅ ９ ８．６％ａｎｄ ｌ ００％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ｉｓ ｒｅｌｉａｂｌｅ。ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ． ｎａｄ ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＳ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ ｄｉｓｋ ｄｉｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ； ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ［Ｊ Ｃｅｎｔ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ Ｓｃｉ），２００７，３２（１）：０ｌ７９—０４］ 收稿日期（Ｄａｔｅ ０ｆ ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）２００５－１１－０９ 作者简介（Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ）陈颖（１９７４－），女，湖南长沙人，主管技师，主要从事临床微生物学研究。 通讯作者（ＣｏｌＴｅＳｐｏｌｕｌｉｎ￣ａｕｔｈｏｒ）陈颖，Ｅ－ｍａｉｌ：ｅｕｔｅｙ＠１６３．ｃｏｍ 维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ８Ｏ 中南大学学报（医学版），２００７，３２（１） 葡萄球菌是引起医院感染的常见病原菌，文 献报道葡萄球菌在阳性标本分离率中所占比例最 高…，其中耐甲氧西林葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔ－ ａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，ＭＲＳ）有逐渐上升的趋势，并具 ＮＣＣＬＳ推荐的琼脂稀释法进行，菌液制备采用孵 育１８～２４ ｈ的单个菌落，接种于含有苯唑西林的 Ｍ．Ｈ琼脂平板上，其药物浓度是一组递减的浓度 （分别为８，４，２，１，０．５，０．２５，０．１ ２５ ｇ／ｍＬ），然 有多重耐药性。ＭＲＳ耐药性的表达分为同质性和 后置于３５℃培养箱中２４ ｈ后观察结果，以 异质性，大部分ＭＲＳ菌株为异质性耐药菌株 ，苯 ＡＴＣＣ２５９２３为标准质控菌株，判断标准同上。 唑西林纸片扩散法、琼脂稀释法测最低抑菌浓度 １．２．３ ｍｅｃＡ基因检测 （ＭＩＣ）和ＭＲＳ筛选试验都不能很好检测出异质性 耐药的菌株 ，ｍｅｃＡ基因ＰＣＲ检测被公认为是判 断ＭＲＳ的“金标准” ，但在临床实验室难以常规 开展。２００４年版美国临床实验室标准化委员会 （ＮＣＣＬＳ）推荐用头孢西丁纸片扩散法检测 ＭＲＳ ，我们将苯唑西林纸片扩散法、苯唑西林琼 脂稀释法和头孢西丁纸片扩散法与ｍｅｃＡ基因的 ＰＣＲ检测法进行比较，评价它们的可靠性和临床 应用价值，以寻找适合医院实验室检测ＭＲＳ的简 单而可靠的方法。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 菌株 湘雅三医院２００４年３月至８月 临床分离葡萄球菌３ １０株，其中金黄色葡萄球菌 １９８株，表皮葡萄球菌４７株，腐生葡萄球菌３６ 株，溶血葡萄球菌２９株，标准菌株为湖南省临检 中心提供的金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３。 １．１．２ 试剂 头孢西丁（３０ ｇ／片）和苯唑西 林（１ ｇ／片）纸片以及Ｍ－Ｈ琼脂均购自ＯＸＯＩＤ公 司；苯唑西林购自中诺药业有限公司；ＰＣＲ扩增所 需试剂均为上海生工工程公司产品，上游引物 Ｐ１：５ －ＴＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＴＣＡＣ从ＴＣＧ－３ ，下游引物 Ｐ２：５ －ＣＴＧＧＡＡＣＴＹＧ１－ｒＧＡＧＣＡＧＡＧ－３ ，扩增片段 为３ １Ｏ ｂｐ。 １．２ 方法 １．２．１ 纸片扩散法 按ＮＣＣＬＳ标准操作规程 进行，菌液制备采用孵育１８～２４ ｈ的单个菌落， 均匀涂布接种于Ｍ－Ｈ琼脂表面，然后将１ ｆｌ，ｇ苯唑 西林纸片及３０ ｇ头孢西丁纸片贴于含菌琼脂表 面，置于３５℃培养箱中２４ ｈ后观察结果，同时检 测各菌株对１ ０，ｇ苯唑西林纸片及３Ｏ ｇ头孢西丁 纸片的敏感性，以ＡＴＣＣ２５９２３为标准质控菌株， 判断标准根据ＮＣＣＬＳ（２００４年）制定的标准 。 １．２．２ 琼脂稀释法 苯唑西林琼脂稀释法按 １．２．３．１ 模板制备 将液体培养基中适量的 指数生长期细菌（最多可达１×１０ ＣＦＵ／ｍＬ），离 心后弃净上清液，用上海生工细菌基因组ＤＮＡ抽 提试剂盒提取ＤＮＡ作为ＰＣＲ的模板。 １．２．３．２ 反应体系 总体积２５ ，其中含 １０×ＰＣＲ缓冲液２．５ Ｌ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ“２．５ Ｌ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５ Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ酶２．５ Ｕ，２５ ｐｍｏｌ／Ｌ的引物１和引物２各１ Ｌ，ＤＮＡ模板５ Ｌ，无菌双蒸水７ Ｌ。 １．２．３．３ 反应条件 ９４℃５ ｍｉｎ预变性，９４℃ ３０ ｓ，５７℃３０ ｓ，７２℃１００ ｓ循环３０次，７２℃延伸 ５ ｒａｉｎ。扩增时以ＡＴＣＣ２５９２３作为阴性对照。 １．２．３．４ 结果判断 ５ Ｌ ＰＣＲ产物点人含ＥＢ 的２％琼脂糖凝胶，０．５×ＴＢＥ为电泳缓冲液，用 水平式电泳槽稳压１００ Ｖ，电泳４５ ｍｉｎ，凝胶成像 系统观察结果、成像。 ２ 结 果 ２．１ ｍｅｃＡ基因检测结果 临床分离的葡萄球 菌３ １０株，经ｍｅｃＡ基因检测，其中耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）为５７．１％（１ １３／１９８），耐 甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）为 ６２．５％（７０／１ １ ２）。ｍｅｃＡ基因检测结果见图１。 ２．２ ４种方法检测结果比较 １９８株金黄色葡 萄球菌ｍｅｃＡ基因阳性为１ １ ３株，苯唑西林纸片扩 散法阳性１ １ ２株，阳性检出率为９９．１％（１ １２／ １ １ ３），假阴性率为０．８８％（１／１ １３），头孢西丁纸 片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法阳性率均为 １００％（１ １３／１ １ ３）；阴性检出率３种方法均为 １００％（８５／８５）（表１）。１ １ ２株凝固酶阴性葡萄 球菌ｍｅｃＡ基因阳性为７Ｏ株，苯唑西林纸片扩散 法阳性６８株，阳性检出率为９７．１％（６８／７０），假 阴性率为２．８６％（２／７０）；头孢西丁纸片扩散法阳 性６９株，阳性检出率为９８．６％（６９／７０），假阴性 率为１．４３％（１／７０）；苯唑西林琼脂稀释法阳性检 维普资讯 http://www.cqvip.com 犯 Ｊ 埘ｉｌ ｌｉｑ林埘蹦蛛蕾 唾ｆｌ＝埘曲 株帕Ｈ 价ｌ∞ ，｝ …率为Ｉ Ｏ０％（７０，／７０）：堆呻旧竹纸片扩做法刚。 ４ｌ株， 舱ｍ半为９７ ６％（４Ｉ／４２），似 ｉ一半 任≤Ｉ ９ ｒｉｌｌＩＩｌＩｌ』．１ 划 刮幂ｆｌ 林 药．≥２０川［１川 ０ｑ ＂削断时壮唑 林域感．没仃ｃｌ，升ｆ『ｌＩ，敞榆删 为２ ３ ８％ｌ Ｉ／４２），－Ｊ 也＿Ｊ｜ｉ ｒ纸Ｈ’扣 ｆ 法 雄 Ｉ 杯琼脂稀释法Ⅲ性榆ｊ¨率均勾ｌ Ｏ０％Ｉ ４２／４２） ｆ裘２１ 林ｉ｛ｉ，、帕 婀邑葡街球ｌ蒋ｌｉＪ比术 Ｉ ＪＬ ｌ林ｆｉｒ＂ 敞 法ｌ ｆ虻巡‘ 水小研’赶资料 『 小，壮Ｉ＾仁 林ｆｔｌ￣，片扩敞 榆 删ＭｌｌｒｑＡ Ｏ！Ｊ敏感 ｆ¨特仲 仆圳为９９．Ｉ （１ Ｉ ２ １ Ｉ ３ Ｉ相Ｉ Ｉ【）［】 ．头孢ＪＪ ｆ 托Ｉ｛如 。澈 Ｊ Ｏ０啊 黄色黼橱球简． 也啊ｒ纸 ；ｉ｛［法 划均１｜Ｊ ｊ川 ＿ －林ｎｉｔ＿．＾ 。 ｒｆ ｉＪ牧ｌｌ‘ ｉｉ 林走。 敞感的金 ９０８ ｂｌ ｉ５２ｉ ｂｌ， Ｊ，Ｌ 幢删址一敛．进 步 Ｊ一＇』、ｆｉ２１｛ ｒ纸”扩 ｆ４０３Ｉ，ｉ ２ｇ１ ｂｐ 做 ｆ ｛此逃ｔ＇ｌ－ ：＇ｔ．ｕｕｈ・葛 苻盘 特 川Ｔ‘幢洲行种矗ｒ ！ｌ 也 ｌ纸Ｉ１ 。 ２２６ｌ Ｉ Ｍｌ｛ １、．忙Ｊ 刈低水 ｒ 平、拌曜比耐药的Ｍ｝｛ ＾． 敞感 （Ｉ Ｏ０嚼） 图１ ｍｎ｛ …犄洲纳 Ｉ：Ａ ＩｆＸ：２５９２３ 准 １１９…Ｈ ４ Ｊ 。 Ｊ 他筛选城骑 刊 ：２—３：ｉｒ ｉｓ＊ｒ＿ …… 抟删站 ：４～８ Ｈ… 拎删站 ；Ｍ：Ｍａｒｋ，・ｒ 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ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，１９９７。１０（４）：７８１—７９１． Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｎｆｉｍｉｃｒｏｂｉｌａ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ； Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［ｓ］．ＮＣＣＬＳ，２００４。 Ｍ１００一Ｓ１４，４７． Ａｎｎｉｅ Ｆ，Ｂｅｍａｄｅｔｔｅ Ｇ，Ｐｎｉｌｉｐｐｅ Ｈ Ｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｃｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ—ｌｅｖｅｌ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ ｔａｐｈ一 ２７６６—２７７１． ［７］ 杜宗敏，杨瑞馥，郭兆彪，等．金黄色葡萄球菌及其甲氧 苯青霉素耐药性的ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ ＭＳ鉴定［Ｊ］．分析测试 学报，２００３，２２（１）：６３—６６． ＤＵ ｚｏｎｇ—ｒａｉｎ，ＹＡＮＧ Ｒｕｉ—ｆｕ，ＧＵＯ Ｚｈａｏ—ｂｉａｏ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉ— ｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｅｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ａｎａｌ，２００３，２２（１）：６３— ６６． ［８］ 张恰滨．基因ｆｅｍＡ和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌不均 一耐药性的关系［Ｊ］．国外医药抗生素分册，２０００，２１ （３）：１２３—１２５． ＺＨＡＮＧ Ｙｉ—ｂｉｎｇ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｆｅｍＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ＭＲＳ ｈｅｔｅｒｏ－ ｇｅｎｉｅ ｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔｎａｔ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｎｏｔｅｓ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０００。２１ （３）：１２３—１２５． （本文编辑 彭敏宁）