维普资讯 http://www.cqvip.com 山西师范大学学报（自然科学版） 第１８卷第２期 ２ ０ ０ ４年６月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｘｉ Ｔｅａｃｈｅｒ ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．２ Ｊｕｎｅ ２Ｏ０４ 文章编号：１００９－４４９０（２００４）０２－Ｏ０７１－０６ 胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究 尹文兵，李丽娟，黄勤妮，李艳红 （首都师范大学生物系，北京１０００３７） 摘要：分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，并建立细胞悬浮 系．实验结果表明：胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体；诱导松散 型愈伤组织的最佳激素浓度配比是１．０ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ；细胞悬浮培养细胞最佳起始 密度为１．１２５×１０ 个／ｍＬ一２．３２５×１０ ＂￣／５０ｍＬ时，７ｄ一９ｄ为对数生长期；继代培养４代一５代 时，可得到稳定的悬浮细胞系． 关键词：胡萝卜；组织培养；细胞悬浮培养；松散型愈伤组织；生长曲线 中图分类号：￥６３１．２ 文献标识码：Ａ 胡萝ｂ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．），属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜作物，由于其 营养价值高，及其适于生食、加工、烹调等多种用途，在世界范围内广泛栽培．中国是农业 大国，胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用．因此，加快我国胡萝ｂ育种研 究以成为迫切需要¨ ．近些年来，随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物 技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标 记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究．我国科研工作者在胡萝ｂ的生物技术与分子 生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合 ］、遗传转化及再生 等方面．但是在胡萝ｂ细胞培养方面并不是太多，因此继续深入研究还是很有必要的． 本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨，为其次 生代谢产物Ｏｔ－胡萝卜素、Ｂ－胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基 础． １材料和方法 １．１材料来源 胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供． １．２方法 收稿日期：２００４－０３－２２ ‘ 作者简介：尹文兵（１９７９一），男，山西安泽人，首都师范大学在读硕士研究生，主要从事功能基因组 学方面的研究． 维普资讯 http://www.cqvip.com ７２ 山西师范大学学报（自然科学版） ２００４年 １，２，１ 胡萝卜愈伤组织的诱导 （１）以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导 ］．将胡萝卜种子搓去种毛，然后在７５％的 酒精中消毒５ｍｉｎ，无菌水冲洗一遍后，用０．１％的升汞消毒１０ｍｉｎ，接着用无菌水漂洗一 遍，再用无菌水浸泡３０ｍｉｎ，最后用无菌水漂洗一遍，接种在无激素的ＭＳ培养基上，１０ｄ 左右种子开始萌发，待两片子叶伸展，而心叶刚刚显露时，将幼苗的下胚轴和子叶切成０．３ ｅｍ左右的小段，接种在附加植物激素１．Ｏｍｇ／Ｌ ２，４一Ｄ，１．０ｍｇ／Ｌ ２，４一Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ， ２．０ｍｇ／Ｌ２，４一Ｄ，２．０ｍｇ／Ｌ ２，４一Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ的ＭＳ培养基的三角瓶中，培养３Ｏ天左 右，即可诱导出愈伤组织．继代培养时，将老的和生长不良的愈伤组织去掉，将大的健康的 愈伤组织切至０．５ｃｍ，再放于含０，ｌｍｇ／Ｌ ２，４一Ｄ的ＭＳ培养基（ｐＨ５．７）上继续培养．诱导 和继代培养均在黑暗条件下进行，培养温度为２５℃，继代培养时间为３周～４周更换一次 培养基．观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化， （２）以胡萝卜直根形成层为外植体诱导．用清水洗净胡萝卜直根，用小刀削去表皮和 顶部，将其在７５％的酒精中消毒５ｍｉｎ，再用０，１％的升汞消毒１０ｍｉｎ，接着用无菌水漂洗 遍，再用无菌水浸泡３０ｍｉｎ，最后用无菌水漂洗一遍．消毒好的胡萝卜直根，切去下边的 ２／３部分，留下部分用消毒好的小刀，沿截面横切成厚度Ｉｍｍ左右的小圆片，然后将小圆 片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再切成长３ｍｍ，宽１，５ｍｍ，高ｌｍｍ的小长块，接 种在（１）中的诱导培养基上，获得愈伤后进行继代培养，培养环境条件与（１）相同． １．２．２胡萝卜细胞悬浮系的建立 用镊子夹取在固体继代培养基上继代２０ｄ左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的 愈伤，接种在含０．３ｍｇ／Ｌ ２，４一Ｄ的液体培养基（ｐＨ５．７）中，每１００ｍＬ的三角瓶中加入液体 培养基５０ｍＬ，摇床转速为１１０ｒ／ｍｉｎ，温度为２５￣Ｃ，黑暗培养．每隔７ｄ继代一次，连续培养 ４代～５代后逐渐形成稳定的细胞系． 细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同，但不加琼脂，每隔 １ｄ在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相，进行细胞计数，以建立细胞数生长曲 线． １．２．３ 细胞悬浮生长曲线的测定 取０．５ｇ悬浮培养物，接入新鲜液体培养基中，进行振荡培养，每隔１ｄ取样１次，共培 养１３ｄ，连续做３次平行实验， １．２，４悬浮细胞数目的测定 用血球计数板法…对胡萝卜悬浮细胞计数，全部操作在无菌环境下进行，每个结果 为４次平行实验的平均值．细胞数按下面公式计算：ｌｍＬ悬浮液中的总细胞数＝Ａ／５×２５ ×１０４×Ｂ，Ａ为５个中方格总细胞数，Ｂ为稀释倍数． ２结果与讨论 ２．１ 外植体对愈伤组织状态的影响 有文献报道，不同外植体的脱分化能力不同，诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状 态也不同．在胡萝卜愈伤组织诱导时，本实验采用三种外植体：胡萝卜子叶、下胚轴和直根 形成层．经过３０ｄ观察发现，三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织．结果如下：以子 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 尹文兵，等：胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究 叶为外植体的大约有２／３诱导获得了愈伤组织，多数愈伤组织呈浅黄色，生长旺盛，质地 松散，含水量大，分散性好，但也有一些状态不好，色泽发暗，选取好的可作为细胞悬浮培 养的材料；以下胚轴为外植体几乎所有都获得＇广愈伤组织，并且愈伤组织生长旺盛，呈黄 色，比较疏松，分散性好。适宜于细胞悬浮培养；而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织 不多，色泽较暗，有些带褐色，愈伤组织生长缓慢．质地较硬，分散度差，不适宜于细胞悬浮 培养．因此，可认为胡萝 下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体． ２．２激素对愈伤组织状态的影响 不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性，而这些因素又是 松散愈伤组织的关键，也是进行细胞悬浮培养的必要前提．因此，本实验诱导胡萝 愈伤 组织及继代培养设计了４种激素组合［见１．２．１（１）］，通过多次继代培养发现，１．０ｍ Ｌ ２，４一Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ组合诱导出的胚性愈伤组织（见圈１）生长旺盛、呈黄色米粒状分散 性好、质地橙软、含水量小，有利于细胞悬浮培养，而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培 养．其他３种组台中，２ ０ｍＶＬ ２，４－Ｄ＋０．５ｍ ｌ＿ＫＴ诱导出的愈伤组织也比较疏松，而另 两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实．有褐化现象．可见．２，４－Ｄ与ＫＴ的结合有利于疏松 敷伤组织的诱导． 圈１胡萝卜松散型愈伤组织左网：胚性禽伤右图：半胚性愈伤 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅｉｍｅｏｍｐａｃｔ ｅａｌｌｉ．ｏｆＤａｕｃｕｓ ｃａｒｏｌａ Ｌｔｋｆｔ：ｅｍｂｒｏｇｅｎｉｅ ｅａｌｌ￣Ｒｉｇｈｔ：ａｅｍｉｅｎ￣ｍｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ２．３继代次数与细胞状态之间的关系 在细胞悬浮培养的过程中，需要不断地进行继代，来筛选出良好的、较稳定的细胞系． 继代过程中，细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化．第１、２次继 代时，细胞悬浮液为白色或浅黄色，混浊，有许多大颗粒，倒置显微镜下观察，细胞多数成 团，保持较旺盛的能力，单细胞大多呈长形、梭形、不规则形（见图２），细胞个体较大； ３、４次继代时，细胞悬浮液变为黄色，比较牯稠，颗粒大小分布均匀，例置显微镜下观察， 的细胞团增多，有的细胞团明显可见有２Ｏ个一３０个球形细胞组成．单细胞数目增 多，而且大多呈球形；５次继代时．细胞悬浮液（见图３）呈透明的黄色，澄清，呈油状流动， 颗粒分布很均匀＋直径大多在０．５ｍｍ～ｌｉ１￣＂１１，倒置显微镜下观察，细胞团和单细胞很多， 大多呈球形（见图４），大小均匀；６、７次继代以上时，悬浮液变得比较澄清，呈浅黄色，悬 浮颗粒大小均匀，倒置显微镜下观察，细胞大多成团．可以清楚的看出细胞星球彤，比较均 维普资讯 http://www.cqvip.com ７４ 山西师范大学学报（自然科学版）２００４年 匀，也有单细胞，但是不多，这可能与细胞聚集成团的特性有关 Ｉ羽２不规则细胞｛１０ ｘ） Ｆｉｇ．２ Ｉｒｒｅｇｕｌａｒ ｃＰｌＩ ｆ Ｉｔ）ｘ、 罔３黄色的细胞悬浮蔽 Ｆｉｇ ３ Ｙｅｌｋ￣ｗ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ 因此，继代培养过程中，随着继代次数的增多，细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色， 由混浊变为澄清、透明，颗粒大小由不均匀到均匀，最终直径在０．。５ｍｍ—ｌｍｍ。倒置显微 镜下观察，单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形，细胞系逐渐趋于稳定． 随后，我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的．ＭＳ培养基上，７ｄ后长出 新的愈伤组织．３０ｄ后长出胡萝ｂ全苗并转人蛭石成活（图５），说明以细胞系转化为新的 愈伤组织生成再生植株是成功的． 【訇４球彤细腱【４０×） Ｆｉｇ．４ Ｇｌｏｂａｌ ｃｅｌｌ（４０×） 罔５再生植株 Ｆｉｇ．５ Ｐｌａｎｔ ｒｅｓｅｎｅｔ￣ｏｎ ２ ４细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响 在细胞悬浮培养时，细胞生长需要一个最低生长密度，低于此密度，细胞生长速率降 低或根本不生长 ．适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间，起始密度过大过小不 仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立．同时，细胞的起始密度对细胞 培养周期也有影响．为此，本实验设计了４个密度梯度：０．４ ｘ１０ ＂￣＇／５０ｍＬ。１．１２５×１０‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 尹文兵，等：胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究 ７５ ￣ｉ＂／５０ｍＬ，２．３２５×１０ ￣ｉ＂／５０ｍＬ，８．８７５×１０ ￣ｉ＂／５０ｍＬ．培养１３ｄ，细胞状态随天数的变化 见表１。 表１不同起始密度细胞状态随天数的变化 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎｓｉｙ ｔｔｈ ｔｈｅ ｄａｙ ０．４×１０ 个 ／５０ｍＬ １．１２５×１０ 个 ／５０ｍＬ ２．３２５×１０ 个 ／５０ｍＬ ８．８７５×１０ 个 ／５０ｍＬ ３ｄ一５ｄ 悬浮液透明，细 悬浮液透明，细 悬浮液透明，呈 悬浮液透明，细 胞增殖较少，细 胞增殖较快，球 浅黄色，有较多 胞增殖较快，细 胞团较多 形细胞团较多 的细胞团，单细 胞团较多，正在 胞少 ７ｄ一９ｄ 悬浮液呈浅黄 悬浮液呈黄色、 悬浮液呈黄色， 悬浮液呈黄色，７ 色，细胞增值较 透明，有很多球 细胞增值较快， 天时细胞迅速增 形细胞团和单细 有较多的细胞， 值并达到顶峰， 快，有较多的细 胞细胞旺 球形细胞团也很 有较多的单细 胞，呈球形 盛 多 胞，呈球形，９天 细胞数开始减少 ‘＾， １１ｄ一１３ｄ 悬浮液呈黄色， 悬浮液呈黄色， 悬浮液有些混 细胞开始衰退， 细胞数目减少， 浊．细胞数逐渐 悬浮液呈浅黄 有色，有空细胞和 些球形空细 有些细胞开始分 减少，单细胞不 胞 化 多 部分死细胞 从上表可以看出，一个好的悬浮细胞系，最初适宜的起始密度是关键的，它直接影响着细 胞系的质量，也影响着一个培养周期内各个时期的时间长短． 生长曲线 ￡３兰￣－ｏ５０００ ；：８８８８ 罄｝羹：８０００ ８：００５０００ｏ １ ３ ５ ７ ９ １１ 培养天数（ｄ） 图６生长曲线 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ 不同起始密度的细胞在进行细胞悬浮培养时，一个培养周期内各个时期的长短和到 达对数生长期时间是有差别的．下面是不同起始密度的细胞培养１３ｄ对细胞培养周期的 影响：细胞起始密度为０．４×１０４＂Ｊ＂／５０ｍＬ时，细胞延迟期较长约３ｄ～５ｄ，可能是细胞首 先需要聚集到一定密度，生长才比较明显．７ｄ达到对数生长期，此时细胞数目增殖近１８ 倍，但持续时间很短，只有一天，然后细胞数开始减少，１ｌｄ时细胞衰退；细胞起始密度为 １．１２５×１４－０Ｊ＂／５０ｍＬ～２．３２５×１４￣／５０ｍＬ时，１ｄ～３ｄ为细胞延迟期，细胞增值比较缓 ０慢，５ｄ以后，细胞开始迅速增长，７ｄ～９ｄ达到对数生长期，此时细胞数目增殖近２５倍，达 到最高峰，９ｄ～１ｌｄ为细胞生长减慢期，在此期间，细胞数目增长缓慢；细胞起始密度为 维普资讯 http://www.cqvip.com ７６ 山西师范大学学报（自然科学版） ２００４仨 ８．８７５ Ｘ １０４＋／５０ｍＬ时，细胞延迟期较短只有１ｄ～２ｄ，７ｄ达到对数生长期，但细胞数目 增殖不到６倍，９ｄ时，细胞增长缓慢，并很快衰退，可能是由于细胞密度过大，培养基营养 耗尽． 因此，由上面的分析，可以得出：进行胡萝卜细胞悬浮培养的最佳起始密度为１．１２５ Ｘ １０４ 个／５０ｍＬ～２．３２５ Ｘ １０４个／５０ｍＬ，它的生长曲线见图６，其培养周期为１１ｄ． ３结论 （１）以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层均可诱导出愈伤组织，其中以下胚轴诱导出 的胚性愈伤组织最适合细胞悬浮培养． （２）诱导松散型愈伤组织最佳激素浓度配比为１．０ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ，最适 温度为２１￣Ｃ～２５￣Ｃ，ｐＨ值为５．８． （３）在４次～５次继代时，细胞系趋于稳定． （４）细胞起始密度在１．１２５ Ｘ １０４￣＂／５０ｍＬ～２．３２５ Ｘ １０４￣ｉ＇／５０ｍＬ时，７ｄ～９ｄ为对数 生长期． （５）悬浮细胞转入ＭＳ固体培养基，７天长出新的愈伤组织，３Ｏ天长出全株，并移植蛭 石成活，目前已经长出胡萝卜． 参考文献： ［１］颜昌敬著．植物组织培养手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９８９．４５１￣４５３． ［２］司家钢．利用原生质体对称融合转移胡萝 瓣化型细胞质不育性的研究【Ｄ］．中国农业科学院博士学位论文， ２００１．３０—３１． ［３］陈薇，梅文泉，赵丰萍，等．菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养［Ｊ］．西南农业大学学报．２００２，２４（２）：１０５—１０７． ［４］甘烦远，郑光植，彭丽萍，等．云南红豆杉细胞的悬浮培养［Ｊ］．植物生理学报，１９９７，２３（１）：４３～４６． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌｌｉ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄａｕｃｕｓ Ｃａｒｏｔａ Ｌ ＹＩＮ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ，ＬＩ Ｌｉ－ｊｕａｎ，ＨＵＡＮＧ Ｏｎ－ｎｉ，ＬＩ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅ／ｉｒｎｇ １０００３７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＣａＵｉ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ，ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ，ａｎｄ ｔａｐｒｏｏｔ ｃａｍｂｉｕｍ ｏｆ Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｒｏｔ．ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｗｅｌ＂ｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ｒＩ．ＩＩｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ ｏｆ Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．ｗａｓ ｐｅｒｆｅｃｔ ｅｘ－ ｐｌａｎｔ ｉｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃａＵｉ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ． ｒＩ．｜Ｉｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １．０ｍｇ／Ｌ ２．４－Ｄ＋Ｏ．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ ｉｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｉｍｃｏｍｐａｃｔ ｃａｌｌｉ．．ｒＩ．ＩＩｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎｓｉ￣ｗａｓ １．１２５ ｘ １０ ～ ２．３２５×１０４ ｃｅｌｌ ｉｎ ５０ｍｌ ｍｅｄｉｕｍｎａｄ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｐｅｒｉｏｄ ｆｏ ｇｒｏｗｔｈ Ｗａｓ ７～９ ｄａｙｓ．ｒＩ．ＩＩｅ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｅｌｌ ｓｕｓｅｐｎ－ ｓｉｏｎ ｌｉｎｅ Ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ４～５ ｓｕｂｃｕｌｔａｒｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ；Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｍ－ｅ；Ｉｍｃｏｍｐａｃｔ ｃａｌｌｉ；ｒＩ．ＩＩｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ
