柿叶片中单宁含量的动态变化研究

柿叶片中单宁含量的动态变化研究＊李泯锟1，程洪斌1，宋超1，窦思远1，王耘1，黄雯2（1.金陵科技学院园艺园林学院，江苏南京210038；2.南京市蔬菜科学研究所，江苏南京210042）摘要：黑柿是一种比较少见的品种，为充分开发黑柿资源中功能性成分，研究对比了不同时期黑柿和红柿（富有甜柿）叶子中的单宁含量并进行柿叶组分鉴定分析。结果表明，监测期内黑柿叶与红柿叶动态变化规律基本一致，呈先下降后上升趋势。果实未成熟期至成熟前期，红柿叶中单宁含量高，而黑柿叶单宁含量高峰时期集中在10月下旬至11月上旬，此时含量高于红柿叶。两种柿叶中含有大量的没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）和儿茶素（Catechin，CA）等单宁组分。贮藏1周两种成分含量会增加，黑柿叶中更为丰富，其提取物具有更好的抗氧化作用，可作为新功能性成分开发利用。关键词：柿叶；黑柿；单宁；动态变化中图分类号：S665.2文献标志码：ADOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2021.03.023水乙醇、无水碳酸钠、乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵，均为国产分析纯。仪器包括超低温冰箱、超高效液相系统（Vanquish，Thermo，USA）、高分辨质谱检测系统（Qexactive，Thermo）、UV-5500型紫外可见分光光度计、高速离心机、恒温烘干箱。1.3测定方法1.3.1柿叶单宁的提取及测定参照韩卫娟等[5]和于晓锐等[8]的提取方法，略作修改，具体如下：称取0.2000g样品，用10mL、60%乙醇在超声波清洗仪中恒温60℃萃取40min，定容至25mL，离心取上清液待测。以牛广财等[9]福林-酚比色法测定，略作修改，利用饱和碳酸钠溶液提供稳定的碱性环境、静置显色反应时间为2h。以没食子酸标准品绘制标准曲线，并进行样品测定。柿单宁含量为：柿叶味苦、涩，富含多酚类、黄酮类、萜类、鞣质等化学成分[1]，具有活血化瘀、降血压等功效[2]，已被开发为保健柿叶茶[3-4]。可溶性单宁是引起涩味的主要物质，也存在于柿果实中[5]，是一种重要的食品功能成分，广泛应用于食品、医疗等领域[6]。目前柿单宁提取多以果实为原料，柿叶利用较少，而韩卫娟等[5]的研究结果显示部分品种的叶片可溶性单宁年均含量高于果实。因此柿叶可作为提取柿单宁的原料，减少对果实资源的浪费。黑柿是黑色柿品种，果实含糖量高，软化后味浓甜，枝条拱形生长，具有观赏价值[7]。黑柿分布少，关于黑柿叶单宁含量动态变化和成分相关的报道极少，前期的研究发现黑柿叶中单宁含量较红柿叶高，是一种较好的新资源。本研究以黑柿和红柿柿叶为主要测定对象，对比不同时期叶片中可溶性单宁含量的变化规律，鉴定单宁含量最高时期的组分，该结果无论对最佳采样时期，还是对原材料的选择都具有重要的指导作用，为充分开发黑柿子资源中功能性成分提供参考。1材料与方法1.1样品采集供试材料：红柿（富有甜柿）、黑柿。从2019-07—2019-11采样于金陵科技学院园艺站，共计12次。液氮速冻后，置于﹣80℃保存。待测样品于95℃下烘干至恒重，研磨成粉末过40目筛，密封置于干燥器中，待后续测定实验使用。1.2材料与仪器材料包括没食子酸标准品（HPLC≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）、福林酚试剂（源叶生物公司）、无——————————————————————————（mgg1）

xVN

m

（1）式（1）中：x为利用标准曲线计算所得到的浓度，mg/mL；V为定容的容量，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。1.3.2单宁清除DPPH自由基能力的测定采用DPPH法测定[10]，用无水乙醇配制成质量浓度为0.065mmol/L的DPPH溶液。将提取所得的柿叶单宁梯度稀释为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL，以相同浓度Vc为对比。将待测液分别与DPPH溶液避光反应30min，在517nm处测定溶液的吸光度，并通过下式计算DPPH自由基清除率。＊［基金项目］2019年度金陵科技学院项目“江苏省大学生实践创新项目”（编号：201913573018Z）·70·2021年第03期

抑制率计算如下：I（%）

Ac－（Ai－Aj）

A100%

（2）c

式（2）中：Ac为乙醇代替样品的吸光度；Ai为DPPH加提取物吸光度；Aj为无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度。1.3.3单宁组分测定1.3.3.1样本预处理取200mg样品，加入2M盐酸，80C酸解3h；取酸解液200μL，旋转浓缩干燥；加入1mL的50%甲醇溶液复溶；14000r/min离心10min，取上清液用C8SPE小柱纯化。1.3.3.2色谱条件色谱系统采用的是超高效液相系统，根据化合物的性质，采用WatersHSST3（50×2.1mm，1.8μm）液相色谱柱，进样量为2μL，柱温为40℃；流动相A（0.1%甲酸-乙腈），流动相B（0.1%甲酸-水）。流动相梯度如表1所示。表1流动相梯度

时间/min流速/minA相/（%）

B相/（%）

0.0

0.31090流动2.00.31090相梯度6.00.36040Eluent9.00.36040gradient

9.10.3109012.0

0.3

10

90

1.3.3.3质谱参数鞘气40，辅助气10，离子喷雾电压为2800V，温度为350℃，离子传输管温度为320℃。1.3.4保存条件对单宁含量的影响采摘后将柿叶干燥处理，低温组中，将叶片置于﹣80℃；干燥组中，将叶片置于干燥器中室温避光保存，7d后按照1.3.3的方法进行含量测定。1.4统计与分析采用SPSS10.0进行数据分析，采用Excel2019进行数据处理及制图。2结果与分析2.1单宁标准曲线没食子酸标准曲线如图1所示，没食子酸的质量浓度在0～0.10mg/mL内与A765吸光值呈良好的线性关系，在此范围内的线性回归方程为y=15.235x+0.0617，R2=0.9983。2.2柿叶单宁含量动态变化监测期内两种柿叶动态变化规律大致相同，均呈现先下降后上升趋势。两种柿叶7月份含量较低且稳定，随后8月份开始下降，此时果实处于幼果至膨大期，可溶性单宁会富集于果实中，8月中旬含量出现最低点，9月中下旬含量迅速上升。红柿叶于10月中旬含量达到最高后下降，黑柿叶9月下旬出现快速富集，且持续上升，在落叶前含量未见下降，是潜在的优质资源。柿叶单宁含量的变化如图2所示。ScienceandTechnology&Innovation┃科技与创新图1没食子酸标准曲线

图2柿叶单宁含量的变化

2.3柿叶单宁的抗氧化性DPPH自由基是一种较稳定的自由基，常应用于抗氧化能力的测定。如图3所示，两种柿叶醇提物对DPPH氧化都具有抑制作用，且存在剂量效应。在相同浓度下，黑柿叶提取液抑制率较红柿叶高。5μg/mL黑柿叶提取物对DPPH自由基清除率为42.17%，同浓度Vc对DPPH自由基清除率为24.09%，与红柿叶提取物清除率相近。20μg/mL浓度下三者对DPPH自由基都有较好的清除效果，高于20μg/mL后Vc的清除效果最好。黑柿叶单宁提取物、红柿单宁提取物和抗坏血酸的IC50分别为6.33μg/mL、11.16μg/mL和11.40μg/mL，因此，黑柿叶提取物有较好的抗氧化能力。柿叶单宁对DPPH清除能力如图3所示。图3柿叶单宁对DPPH清除能力

2.4柿叶单宁组分分析由图3可知，柿叶中检测出8种单宁组分，分别是没食子儿茶素（Gallocatechin，GC）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin，EGC）、儿茶素（Catechin，CA）、表儿茶素（(Epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯·71·科技与创新┃ScienceandTechnology&Innovation（Epigallocatechingallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（Gallocatechingallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechingallate，ECG）和鞣花酸（Ellagicacid），其中GC和CA含量最多，尤其是常温贮藏7d的黑柿叶其中GC含量（23.43ng/mg）是红柿叶的（3.1ng/mg）7倍多，CA含量达到了37.65ng/mg是红柿叶的5倍多。通过贮存试验发现，无论常温还是低温，7d后GC、EGC、CA、EC出现含量上升的现象，常温贮藏条件更利于黑柿叶中成分富集，而低温利于红柿叶；有研究表明水不溶性酚类物质在贮藏期间可转化为可溶性物质，部分酚类物质的氧化中间产物也可能被还原[11]，导致含量升高，但是具体原因还需要进一步研究。EGCG、GCG、ECG和鞣花酸含量在贮藏过程中降低。此外柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷和槲皮素两种黄酮类物质含量非常丰富，烘干的红柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量可达到230.73ng/mg，槲皮素含量为278.23ng/mg，烘干的黑柿叶中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量为151.53ng/mg，槲皮素含量为124.02ng/mg。但是黑柿叶中芦丁和芹菜素含量非常少，因此，成分的测定可为开发柿叶新功能奠定基础。黑柿叶中单宁组分的变化如图4所示。红柿叶中单宁组分的变化如图5所示。图4黑柿叶中单宁组分的变化

图5红柿叶中单宁组分的变化3讨论与结论柿叶中含有黄酮甙类、二萜类、茶多酚、橙皮甙等活性物质[12]，本试验利用超声波辅助提取法对柿叶中的单宁进行提取，结果表明，柿叶中单宁的积累随着生长发育时期的不同而变化，且具有一定的规律性。富有甜柿和黑柿叶中单宁·72·2021年第03期

含量动态变化规律大致相同，均呈现先下降后上升趋势。7月份含量较低且稳定，随后8月中旬含量下降出现最低点，这可能是果实的生长和其中单宁富集有关，9月中下旬迅速回升此时果实逐渐成熟。富有甜柿叶在10月中旬达到最高峰，而黑柿叶自9月下旬至落叶前一直呈增长趋势，尤其是落果后黑柿叶中单宁含量丰富，可作为单宁提取的资源，既可避免资源浪费，又可提高经济效益。柿果中单宁含量在7—8月达到峰值，与柿叶单宁出现错峰，即叶片中含量自幼果期缓慢下降后，成熟后期迅速升高，但是关于柿果与叶片中单宁成分和含量是否存在相关性尚需进一步研究。该研究对两种柿叶中单宁的抗氧化活性进行探究，在设定的浓度范围内，单宁与DPPH清除率呈现剂量关系，较低的值表明更高的自由基清除能力，IC50说明黑柿叶提取物是一种较好的抗氧化物质。分析两种柿子叶成分得知，黑柿叶和红柿叶中单宁的存在形式和含量并不一致。其中GC和CA含量在单宁物质中最丰富，黑柿叶中这两种成分含量都高于红柿叶，贮藏7d后含量还会升高。同时柿叶中还含有槲皮素及其衍生物等多种黄酮类物质。中国柿品种丰富，资源开发利用潜力巨大，今后应在开发、推广新资源的基础上深入研究有效成分及生物生产特性，为柿资源的进一步深加工和利用奠定基础。参考文献：1］卢鑫，李晓乐.柿叶中化学成分及其药理作用研究［J］.化学教育，2016，37（24）：5-9.2］严铸云，文佳燕.川产柿叶的生药学研究［J］.成都中医药大学学报，2001（3）：42-44.3］刘田田，夏霜慧，周瑞金.柿叶茶的保健功能及其制作工艺［J］.中国食物与营养，2013，19（10）：54-55.4］彭孟凡，刘保松，苗明三.柿叶现代医疗应用探讨［J］.中南药学，2018，16（3）：373-376.5］韩卫娟，李加茹，梁玉琴，等.柿果实和叶片中可溶性单宁含量的年变化［J］.南京林业大学学报（自然科学版），2015，39（6）：61-66.6］陆笛，黄思婕，龙明华，等.“恭城月柿”不同生育期果实和叶片单宁组分含量的变化［J］.广西植物，2020，40（5）：735-743.7］杨勇，李高潮，王仁梓.黑柿［J］.西北园艺，1999（1）：34.8］于晓锐，钱文华，但汉龙，等.柿叶多酚的超声辅助乙醇提取法优化及其抗氧化活性评价［J］.中国南方果树，2018，47（4）：112-116.9］牛广财，闫公昕，朱丹，等.Folin-Ciocalteu比色法测定沙棘酒中总多酚含量的工艺优化［J］.食品与机械，2016，32（4）：80-83，142.（下转第76页）［［［［［［［［［科技与创新┃ScienceandTechnology&Innovation5总结一般地方高校以应用型人才培养为核心，在新工科建设与人才培养过程中，需要构建特色与个性化培养相结合的人才培养方案，打造校内校外双向闭环的教学质量保障体系。以“三进”为原则进行人才培养方案重构，以“大工程观”重构人才培养体系，以培养工程型、复合型人才为主线，从学科交叉、专业融合的视角构建课程体系，整合教学内容，改进教学方法，为从多视角、多维度构建一般地方高校新工科人才培养体系奠定基础。参考文献：［1］吴爱华，杨秋波，郝杰.以“新工科”建设引领高等教育创新变革［J］.高等工程教育研究，2019（1）：1-7.［2］吴岩.勇立潮头，赋能未来——以新工科建设领跑高等教育变革［J］.高等工程教育研究，2020（2）：1-5.［3］顾佩华.新工科与新范式：实践探索和思考［J］.高等工程教育研究，2020（4）：1-18.2021年第03期

［4］施晓秋，赵燕.融合、开放、自适应的地方院校新工科体系建设思考［J］.高等工程教育研究，2017（4）：10-12.［5］林健.新工科建设：强势打造“卓越计划”升级版［J］.高等工程教育研究，2017（3）：7-14.［6］吴秋凤，李洪侠，沈杨.基于OBE视角的高等工程类专业教学改革研究［J］.教育探索，2016（5）：97-98.［7］李茂国，朱正伟.工程教育范式：从回归工程走向融合创新［J］.中国高教研究，2017（6）：30-36.［8］蒋宗礼.本科工程教育：聚焦学生解决复杂工程问题能力的培养［J］.中国大学教学，2016（11）：27-30.————————作者简介：张辉，男，吉林梨树人，硕士，副教授，研究方向为高校教育管理、教育信息化、数字媒体技术。〔编辑：张思楠〕（上接第69页）5结论实践表明，在工作面采用高压气体预裂爆轰技术并进行注水试验后，一方面可以明显提高煤体含水率；另一方面，减少了采煤作业中的产尘量，改善了矿工作业环境，同时也降低了工作面工人患尘肺病的风险。参考文献：［1］林传兵.寺河矿煤层脉动注水降尘技术研究［J］.中国矿业，2020，29（1）：171-175.［2］张雷，孙中永.厚硬顶板深孔预裂爆破弱化试验及评价［J］.煤炭科技，2015（1）：21-22.［3］张劲松，武腾飞.综采工作面煤层注水降尘技术试验研〔编辑：张思楠〕究［J］.煤炭技术，2016，35（10）：173-175.［4］申磊.172106工作面煤层短臂高压注水预裂技术的应用与效果研究［J］.山东工业技术，2014（6）：108-109.［5］张有狮.煤矿井下水力压裂技术研究进展及展望［J］.煤矿安全，2012，43（12）：167-169，176.————————作者简介：李志勇（1980—），男，研究生，毕业于山东科技大学安全工程专业，工程师，现从事兴隆庄煤矿通防科管理工作，从事一通三防工作10年。（上接第72页）［10］杜凯，马养民，郭林新.杏仁皮单宁提取工艺优化及其DPPH自由基清除活性［J］.食品工业科技，2019，40（21）：174-178.［11］陆锦时，谭和平.绿茶贮藏过程主要品质化学成分的变化特点［J］.西南农业学报，1994（Suppl1）：77-81.［12］杨恒，赵萍，刘裕慧，等.柿子资源开发利用现状［J］.生物资源，2019，41（5）：402-410.————————作者简介：李泯锟（1998—），男，四川江油人，本科在读，金陵科技学院园艺园林学院学生，研究方向为园艺。程洪斌（1999—），男，江西上饶人，本科在读，金陵科技学院园艺园林学院学生，研究方向为园艺。宋超（1999—），男，江苏盐城人，本科在读，金陵科技学院园艺园林学院学生，研究方向为园艺。通讯作者：王耘（1985—），女，江苏南京人，博士，金陵科技学院园艺园林学院副教授，研究方向为园艺作物品质检测。〔编辑：张思楠〕·76·