湿式超微粉碎提取三七总皂苷及粒径对提取
率的影响1
贺建东，付廷明，郭立玮，
南京中医药大学中医药研究院，南京（210029）
E-mail: guoliwei815@ yahoo.com.cn, rocketed163.com
摘 要：目的：研究湿式超微粉碎法与传统提取方法对三七总皂苷提取的影响及粉碎粒径与提取率的关系。方法：以三七总皂苷为指标，高效液相法测定提取率以及粒径分布仪测定粒径。结果：湿式超微粉碎法提取率较普通回流法略有提高，但普通回流法需要2小时，而湿式超微粉碎法只需10分钟，节省了时间；超微粉碎随时间的增加，粒径越来越小，但提取率并没有增加。结论：湿式超微粉碎与提取同步完成，极大的提高了提取的效率；粉碎粒径与提取率并不呈现比例关系。
关键词：三七总皂苷；超微粉碎技术；HPLC法；粒径分布；显微观察
三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F. H.Chen的干燥根，具有散瘀止血，消肿定痛的作用，是传统活血化瘀良药。三七的主要有效成分为三七皂苷类化合物，可溶于水和乙醇中。三七中皂苷成分的提取多以水或醇为溶剂进行加热回流[1]及浸泡提取[2]，并在工业及含量测定中广泛应用。但三七质地坚硬，难以粉碎到适宜的粒度，使得一般回流提取耗时较长且操作繁琐。
超微粉体技术可将中药材从传统粉碎工艺得到的中心粒径150～200目的粉末（75µm以上），提高到中心粒径达10µm左右，在该细度条件下，一般药材细胞的破壁率大于95%。而湿式超微粉碎法是指把溶剂与中药一起加入超微粉碎机，使粉碎与提取同步完成，极大的提高了提取的效率。粉碎程度与提取率的关系鲜有报道，本文采用粒径分布仪与高倍显微镜，从微观方面显现粉碎程度与提取率之间的关系。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气机，VWD检测器，化学工作站。三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rb1、Rg1对照品（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号分别为：110745-200415、110703-200424、110704-200420），湿式微粉机（自制），三七药材购于南京市药材公司，经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》（2005版）有关规定。乙腈为色谱级，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定的方法
2.1 1 色谱条件：
[3]
系统适应性试验色谱柱为汉邦C18柱(250mm×4.6mm，5µm)；流动相：乙腈-水梯度
洗脱(0~12min，19%乙腈，12~60min，19%~36%乙腈)；流速：1mL·min-1；检测波长203nm；柱温：30℃。
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本课题得到教育部博士点基金(20060315007)；江苏省教育厅自然科学基金(05KJD360155)的资助。
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2.1.2 对照品的制备
精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成浓度为0.080mg·mL-1三七皂苷R1，0.317mg·mL-1人参皂苷Rg1和0.267mg·mL-1人参皂苷Rb1的混合对照品溶液，备用。 2.1.3 线性关系考察
分别精密吸取对照品溶液6、8、10、12、14、16、18µL，注入高效液相色谱仪，以进样质量X(µg)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到3条对照品的线性回归方程，结果分别为y=41.96x+83.92、。y=191.44x+382.88、y=127.02x+254.04。 2.1.4 稳定性试验考察
取同一份样品，按供试品溶液的制备项下方法配制成供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24h进行测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为：0.95%、0.63%、0.72%，结果表明样品溶液在24h内稳定。 2.1.5 重复性考察
取同批号5份样品，按供试品溶液的制备项下方法配制成供试品溶液进行测定，5份样品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为：1.57%、2.04%、1.95%，结果表明本方法具有较好的重复性。 2.1.6 精密度试验
精密吸取标准溶液10µL，重复进样5次，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD值分别为：0.75%、0.68%、0.83%，结果表明仪器精密度良好。 2.1.7 提取溶剂的选择
根据文献[4]资料，三七皂苷能溶于水及乙醇等有机溶剂，故考察三七用不同溶剂提取的效果。分别称取5g三七粉末倒入锥形瓶中，精密加50 mL水，30%乙醇，70%乙醇，称定重量。80℃回流2小时，放冷，补足失重。滤过，取续滤液1ml入10 mL容量瓶，用70%乙醇定容至刻度，用HPLC法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1的含量，计算其提取率。结果见表1
表1 不同溶剂提取三七总皂苷的含量
溶剂 水 30%乙醇 70乙醇
三七皂苷R1 0.605
0.618 0.684
人参皂苷Rg1 2.692 2.606 3.641
人参皂苷Rb1 1.991 2.131 2.414
总皂苷 5.288 5.355 6.739
2.1.8 超微粉碎
由表1可知，70%乙醇提取效果最好，故超微粉碎以其为溶剂。取100g三七块状药材，加1000 mL 70%乙醇，倒入微粉机，粉碎，分别于5，10，15，30，50分钟取出少量药液，离心，吸1mL放入10 mL容量瓶，70%乙醇定容到刻度，用HPLC法测定三七皂苷R1、人
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参皂苷Rb1、Rg1的含量，计算其提取率。结果见表2
表2 超微粉碎的时间与提取率的关系
时间 5 10 15 30 50
2.1.9 粒径分布
三七皂苷R1 0.725 0.732 0.718 0.709 0.692
人参皂苷Rg1 3.796 3.803 3.731 3.726 3.683
人参皂苷Rb1 2.462 2.521 2.503 2.386 2.410
总皂苷 6.983 7.056 6.952 6.821 6.785
分别把超微粉碎5、10、15、30、50分钟混悬液样品滴加入粒径分布仪，得出的数据用OriginPro7.5软件处理，结果见图1：
5.55.04.54.0Intensity3.53.02.52.01.51.00.50.010100 5min 10min 15min 30min 50min 1000-3particle size(mm)
图1 超微粉碎不同时间时粒径分布
2.1.10 显微观察
分别把超微粉碎5、10、15、30、50分钟混悬液样品稀释10倍，滴加到载玻片上，显微镜下放大400倍观察，分别选取具有代表性的5、30分钟显微图，结果见图2：
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图2 超微粉碎5、30分钟时的显微图片（×400）
3 讨论
由方法学研究表明，用HPLC法测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1的准确度和灵敏度较高，实验操作相对简单，适用于本文的研究。表1可知，三七用70%乙醇提取2小时效率较高，与文献[1]报道结果一致，普通回流多用此法。表2可知，超微粉碎10分钟提取效果较好，三七总皂苷含量达7.056%，而继续粉碎其含量反而下降。湿式超微粉碎法提取率较普通回流法略有提高，但普通回流法需要2小时，而湿式超微粉碎法只需10分钟，且操作简单，温度可控制，粉碎与提取同步完成，极大的提高了提取的效率。
图1表明随时间的增加，粒径越来越小：5分钟时大部分为100µm以上颗粒，仅有20%左右为10µm的超微粒度，粉碎10分钟后达30%，30分钟时以10µm左右均匀分布。显微结果表明，5分钟时细胞壁清晰可见，30分钟时几乎全部破壁。结合提取率，表明超微粉碎粒径与提取效率并不呈现比例关系：当粉碎10分钟时，粒度大部分为100µm左右，而提取效率最高，达7.056%；粉碎50分钟时，粒度基本在10µm左右，显微图也表明，细胞基本已经破碎，但提取率反而有所降低。可能是粒子粒径减小，表面能增加，吸附了一部分三七皂苷，使提取率反而下降。
参考文献
[1]瞿林海, 郑明, 楼宜嘉. 三七总皂苷提取工艺研究[J].中药材,2006,29（6）:593-595 [2]何静雯, 罗干明. 正交试验法优选三七提取工艺[J].中成药,2005,27（8）:964-966 [3]中国药典2005年版一部[S].2005:10
[4]刘向前. 三七总皂昔水提取工艺的优化试验[J].中国药师,2006,9（3）:215-216
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Wet ultrafine grinding technology extracted the total saponins from Panaxnotoginseng and the relationship
between the size and the extraction rate
Hejiandong, Futingming, Guoliwei
Traditional Chinese Medicine Institute of Nanjing university of Traditional Chinese Medicine
Nanjing （210029) Abstract
Objective: To study the wet AMD to crush the traditional method of extraction method PNS from the impact and crush size and the relationship between the extraction rate. Method: PNS as an indicator, Determination of extraction rates, and to measure the particle size distribution. Results: wet UGT to crush extraction rate of return than ordinary law increased slightly, but the common law needs to return two hours, and the method of wet UGT to crush 10 minutes, saving time; UGT to crush the increase with time, Size getting smaller and smaller, but the extraction rate has not increased. Conclusion: The wet UGT to crush and extract synchronization completed, greatly improving the efficiency of the extraction; smash the size and the extraction rate does not show the proportion relations.
Keywords: The total saponins from Panaxnotoginseng; ultrafine grinding technology; HPLC method; Particle size distribution; Microscopic observation
作者简介： 贺建东(1983-)，江苏常州人，南京中医药大学硕士在读，主要从事药物新剂型与新技术研究； 郭立玮，教授，博士生导师，通信作者。
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