T细胞因子4在胃癌细胞增殖凋亡中的作用研究

林明政;沈国栋;沈干;徐佳慧;程民;徐婷娟;胡世莲

【摘 要】目的 研究T细胞因子4(TCF4)在胃癌细胞中的表达以及对胃癌细胞增殖及衰老、凋亡中的作用.方法 培养人胃癌细胞株MGC803、SGC7901、HSC44-PE、44As3、MKN45、NCI-N87以及人永生化胃黏膜上皮细胞株GES-1,使用Western blot法比较TCF4在各细胞之间的表达差异.选择其中TCF4表达高与低的细胞株,分别通过稳定转染TCF4表达质粒及dominant negative TCF4(dnTCF4)的方法上调与下调细胞TCF4表达,采用体外细胞增殖实验及实时无标记细胞检测分析(RTCA)等技术检测TCF4对胃癌细胞增殖与凋亡的影响.建立胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,观察TCF4蛋白对胃癌移植瘤生长的影响.结果 TCF4在胃癌细胞中的表达高于对照GES-1细胞.胃癌细胞株按TCF4的表达量从高到低排列依次为NCI-N87、44As3、HSC44-PE、MGC803、MKN45、SGC7901.TCF4的表达与胃癌细胞的增殖能力呈正相关性,而与胃癌细胞的衰老、凋亡呈负相关性.结论 TCF4在胃癌细胞中呈高表达,其能促进胃癌细胞的增殖、抑制胃癌细胞的衰老及凋亡. 【期刊名称】《安徽医科大学学报》 【年(卷),期】2016(051)008 【总页数】5页(P1092-1096) 【关键词】胃癌;TCF4;增殖;凋亡

【作 者】林明政;沈国栋;沈干;徐佳慧;程民;徐婷娟;胡世莲

【作者单位】安徽医科大学附属省立医院老年病科,老年医学研究所,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省

重点实验室,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥230001;肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥230001 【正文语种】中 文

【中图分类】R730.2;R735.2

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率分别位居第二位和第三位［1-2］。Wnt信号通路是动物胚胎发育、细胞生长增殖的重要信号通路。既往研究［3-4］显示，Wnt信号通路的异常激活与肠癌等多种肿瘤的发生密切相关，但其在胃癌发生、发展中的作用仍不清楚。T细胞因子4（T cell factor 4，TCF4）是TCF家族的一员，其基因是TCF7L2（transcription factor 7-like 2），是Wnt信号通路中重要的信号分子［5-6］。该研究以TCF4为研究对象，探索其在胃癌细胞中的表达以及在增殖与衰老、凋亡中的作用。 1.1 材料

1.1.1 实验细胞 人永生化胃黏膜上皮细胞株GES-1、人胃腺癌细胞株MGC803、SGC7901、MKN45购自中科院上海细胞生物学研究所；人胃腺癌细胞NCI-N87购自中国医学科学院北京肿瘤细胞研究所；人胃癌细胞株44As3及HSC44-PE由日本名古屋大学武井佳史教授赠送。

1.1.2 质粒及菌株 pspax2、pMD2G质粒、DH-5α感受态E.coli由中国科技大学钟永军博士赠送；表达EF1alpha-dnhTcf4/SV40-PuroR质粒的EdTP菌种购自美国Addgene公司；TCF4全长序列表达质粒购自美国Origene公司。 1.1.3 实验动物 裸鼠（BALB/c-nu）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，22只，雌性，6～8周龄，饲养于安徽医科大学附属省立医院SPF级动物房中。

1.1.4 主要试剂 RPMI 10培养基、胎牛血清（FBS）购自美国HyClone公司；胰酶消化液、RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自上海碧云天公司；蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂购自瑞士Roche公司；DMEM培养基、BCA试剂盒、化学发光显影液购自美国Thermo公司；β-actin、TCF4兔抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG购自美国Cell Signaling Technology公司；Axyprep质粒DNA小量试剂盒购自美国Axygen公司；转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。 1.2 方法

1.2.1 细胞培养 以上细胞解冻复苏后，培养于含10%FBS的RPMI 10培养基中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。

1.2.2 Western blot法检测 提取正常生长的GES-1、MGC803、SGC7901、NCI-N87、44As3、MKN45及HSC44-PE细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度并用PBS调平，加入蛋白上样缓冲液煮沸5 min，经SDS-PAGE电泳分离后半干转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温条件下封闭1 h。一抗以兔抗人β-actin为内参，兔抗人TCF4为目的蛋白，4℃孵育过夜。以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，使用化学发光凝胶成像系统成像检测各组细胞TCF4的差异表达。 1.2.3 质粒的扩增及提取 将待扩增的pspax2、pMD2G质粒分别转入DH-5α感受态E.coli中，按照质粒使用说明使用含有适量Ampicillin的LB固体培养基筛选菌株，在LB固体培养基中挑取单克隆菌落接种到LB液体培养基中，置于气浴摇床中37℃、200 r/min摇菌12～18 h。质粒的提取步骤如下：取10 ml转入质粒的菌液加入离心管中，10 000 r/min离心1 min，弃上清液；加入500 μl Buffer S1重悬细菌，再加入500 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4～6次，使菌体充解，室温放置5 min，直至溶液变得透亮黏稠；加入700 μl Buffer

S3，上下翻转6～8次见形成白色絮状沉淀，10 000 r/ min离心10 min，吸取上清液加入到制备管中并将制备管置于收集管中，10 000 r/min离心1 min，弃滤液；将制备管放回收集管中，加入500 μl Buffer W1，10 000 r/min离心1 min，弃滤液；将制备管放回收集管中，加入700 μl Buffer W2，10 000 r/min离心1 min，弃滤液，重复上一步骤1次；将制备管放回收集管中，10 000 r/min离心1 min，取出制备管置于超净台中室温干燥30 min后，移入新的1.5 ml EP管中，加入60～80 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min，10 000 r/min离心1 min收集扩增的质粒；分光光度计测定质粒浓度。

1.2.4 慢病毒包装及感染 包装慢病毒前1 d，在3.5 cm培养皿中接种适量密度的293T细胞，每个样品需要1×106个293T细胞。包装步骤如下：取1.5 ml灭菌EP管，加入2 μg EdTP、3 μg pspax2、1 μg pPD2G质粒以及250 μl的无血清培养基，轻柔混匀，室温孵育5 min；取1.5 ml灭菌EP管，取9 μl脂质体LP2000溶于250 μl无血清培养基中，轻柔混匀，室温孵育5 min；将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育20 min；用胰酶消化并记数293T细胞并用含血清的培养基重悬细胞；在6孔板中每孔加入1 ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物；将1 ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中，37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育过夜；移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以DMEM培养基；转染后48～72 h取上清液，3 000 r/min离心20 min，取上清液即为病毒悬液。感染24 h前，分别在3.5 cm培养皿中接种适量密度的44As3、NCI-N87细胞（约2×105/ml），待细胞生长面积达50%～80%时即可用于慢病毒感染。取2 ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量的慢病毒悬液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h；更换新鲜培养基继续培养48～72 h后，加入purocymin进行筛选获得konck-down TCF4的44As3/dnTCF4、N87/dnTCF4细胞。

1.2.5 质粒转染 转染24 h前，在3.5 cm培养皿中接种适量密度的SGC7901细胞（约2×105/ml），待细胞生长面积达50%～80%时即可用于转染。配制溶液1：240 μl无血清培养基+10 μl LP2000，室温孵育5 min；溶液2：250 μl无血清培养基+2 μg TCF4表达质粒，室温孵育5 min；将溶液1与溶液2混合，室温下放置20 min；将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞2遍后，加入2 ml无血清培养基；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；置于在37℃、5%CO2细胞培养箱中保温4～6 h；更换含有血清的全培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，按照1∶10接种到新的培养皿中继续培养，根据质粒使用说明书加入适量purocymin进行筛选获得knock-in TCF4的SGC/TCF4细胞。

1.2.6 细胞增殖实验 取对数期生长的SGC7901、SGC/TCF4、NCI-N87以及N87/dnTCF4细胞株，PBS清洗2遍，胰酶消化，细胞计数，按每个3.5 cm培养皿接种105个细胞，重复3次，分别在24、48、72 h时观察细胞生长状态并消化、计数，比较SGC/TCF4与对照SGC7901细胞，NCI-N87与对照N87/dnTCF4细胞的增殖能力。

1.2.7 实时无标记细胞检测技术（RTCA） RTCA是基于微电子传感技术，通过实时监测阻抗的变化来进行细胞增殖、转移、耐药等实时细胞分析［7］。在配套的E16孔板中每孔接种2×104个细胞，观察、比较SGC7901与SGC/TCF4以及NCI-N87与N87/dnTCF4的增殖情况。

1.2.8 细胞衰老检测 取对数期生长的SGC7901、SGC/TCF4、NCI-N87以及N87/dnTCF4细胞株，PBS清洗2遍，胰酶消化，细胞计数，按每个3.5 cm培养皿接种5×103个细胞，48 h后参考文献［8］使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色，选择3个不同视野统计阳性细胞。

1.2.9 裸鼠成瘤实验 裸鼠经适应性饲养1周后进行试验。取预先培养呈对数期生长

的胃癌细胞消化，1 000 r/min离心，PBS重悬使细胞密度达到1× 107/ml，裸鼠胁部皮下接种0.1 ml，每种胃癌细胞接种6只裸鼠，待细胞成瘤后用游标卡尺每周测量2次肿瘤体积，比较上调TCF4表达的SGC/TCF4与对照组SGC7901、下调TCF4表达的44As3/dnTCF4与对照组44As3的肿瘤生长情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析，多组样本均数的比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD-t检验，方差不齐者采用Games-Howell检验。 2.1 TCF4在胃癌细胞中表达 TCF4在胃癌细胞中的表达要高于对照GES-1细胞，胃癌细胞按TCF4表达量从高到低表达排列依次为NCI-N87、44As3、HSC44-PE、MGC803、MKN45、SGC7901（图1A）。

2.2 TCF4促进胃癌细胞增殖 通过质粒转染等手段，建立knock-in TCF4的SGC/TCF4及knockdown TCF4的N87/dnTCF4细胞系，Western blot法证实TCF4在SGC/TCF4表达升高、在N87/dn TCF4表达降低（图1B、1C）。细胞增殖实验结果显示TCF4调高组细胞SGC/TCF4相较于SGC7901细胞，其增殖能力明显提高（图2A），而TCF4调低组细胞N87/dnTCF4相较于NCI-N87细胞，其增殖能力明显降低（图2B）；这一结果也在RTCA实验中得到进一步证实（图2C、2D）。

2.3 TCF4抑制胃癌细胞衰老与凋亡 细胞培养过程显示，相较于NCI-N87细胞，N87/dnTCF4细胞出现更多的凋亡细胞；而在SGC7901与SGC/TCF4对照中，SGC/TCF4细胞出现更多的多伪足状细胞，提示其有更高的活力及迁移能力（图3）。为了证实TCF4是否能抑制胃癌细胞的衰老和凋亡，选用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色，结果提示N87/dnTCF4细胞染色阳性率明显高于NCI-N87细胞，SGC/TCF4细胞染色阳性率明显低于SGC7901细胞（P＜0.05）（图4）。

2.4 TCF4促进胃癌裸鼠移植瘤生长 按照实验方法1.2.9建立裸鼠移植瘤模型，10

d后结果显示所有接种点均成瘤，生长14 d肿瘤体积测量结果显SGC/TCF4细胞移植瘤体积显著大于对照SGC7901移植瘤，而44As3/dnTCF4移植瘤体积显著小于44As3移植瘤（图5），从而证明TCF4能促进胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长。 胃癌是严重危害人类身心健康的恶性肿瘤，然而由于其早期临床症状表现不明显，且缺乏特异有效的生物标志物，目前仅有少数患者能得到早期诊断及治疗［9-10］。因此，深入研究胃癌的发生、发展机制，对胃癌的早期诊断及治疗具有重要意义。Wnt信号通路是一条在进化上高度保守的信号通路，其活性受多种蛋白调节，而其中TCF4蛋白是Wnt信号通路的关键调节因素之一，表现为当Wnt蛋白与细胞膜表面的Frizzled家族跨膜蛋白（FZ）受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白结合时，可引起β-catenin在细胞质内大量聚集并进入细胞核，入核的β-catenin与TCF4结合形成β-catenin-TCF4复合物，激活Wnt信号通路下游诸如原癌基因c-Myc、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）等在内的一系列靶基因［3，5-6］。既往的研究已经证实Wnt信号通路的异常激活与肠癌等多种肿瘤的发生密切相关，而这其中TCF4的异常表达在这一过程中发挥着重要作用，Chen et al［11］报道TCF4能直接与LIN28B基因的内含子结合并促进LIN28B基因的表达，增强人乳腺癌、肺癌细胞的干细胞潜能，促进人乳腺癌、肺癌的生长与转移；研究［12］表明分化诱导因子-1能通过降低TCF4表达抑制人乳腺癌与宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。

本实验以Wnt信号通路的关键蛋白TCF4为研究对象，结果显示TCF4在胃癌细胞中的表达量明显高于胃黏膜上皮细胞，这与课题组在临床标本中的检测结果一致。选取TCF4表达最高NCI-N87、44As3细胞及表达最低的SGC7901细胞，通过慢病毒包装及质粒转染手段分别获得TCF4调高组细胞SGC/TCF4及调低组细胞N87/dnTCF4、44As3/ dnTCF4，体外细胞增殖实验及RTCA实验结果显示SGC/TCF4细胞增殖能力明显高于SGC7901细胞，N87/dnTCF4细胞增殖能力

明显低于N87细胞，差异有统计学意义；镜下形态学观察及细胞衰老染色显示N87/dnTCF4细胞染色阳性率高于NCI-N87细胞，SGC/TCF4细胞染色阳性率明显低于SGC7901细胞；之后通过建立裸鼠荷瘤模型，观察比较胃癌细胞在体内生长情况，14 d结果显示SGC/TCF4组肿瘤体积明显大于SGC7901组，44As3/dnTCF4组肿瘤体积明显小于44As3组。

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