金属离子对重组大肠杆菌发酵生产α—环糊精葡萄糖基转移酶的影响

金属离子对重组大肠杆菌发酵生产α—环糊精葡萄糖基转移酶的影响

作者：罗宇笛 李啸 张江 石小丹 来源：《天津农业科学》2014年第12期

摘 要：本文研究了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响。首先，采用单因素分析确定几种微量元素的最佳产酶浓度；其次，通过两水平析因试验确定了关键的影响因子及其最大响应区域，其分别是MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O；最后，通过 Box-Benhnken中心组合试验建立数学模型，并采用响应面分析法获得了微量元素的最优配比参数为：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1， CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。与对照组相比，酶活提高了1.4倍。 关键词：大肠杆菌；α-环糊精葡萄糖基转移酶；金属离子；响应面设计

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.12.003 α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成员，是微生物所产的胞外酶，能够催化4种反应——歧化反应、环化反应、偶合反应和水解反应[1-3]。

天然的CGT酶大部分来自嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和软化芽孢杆菌，而构建的基因工程菌为大肠杆菌[4]。基因工程菌在生长和产酶过程中需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等物质；一些微量元素如钙、铁、锌对酶活性中心或辅酶的生成以及酶激活剂的作用有着重要影响[5-8]。本研究采用单因素实验、两水平析因实验、中心组合设计实验和响应面分析法探讨了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响，并得到优化的配比，为α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产具有一定的指导意义。 1 材料和方法 1.1 材 料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。 1.1.2 试剂 酵母浸出物 （FM818，简称YE）由安琪酵母股份有限公司生产；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生产；其他试剂均为分析纯AR。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂粉16。

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液体培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。 1.2 方 法

1.2.1 种子培养 将斜面菌样接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，制备2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 摇床上培养8 h。

1.2.2 发酵培养 将5 mL种子瓶菌样接入装有100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和180 r·min-1摇床上培养40 h。

1.2.3 菌体生物量的测定 采用分光光度计测定发酵液在600 nm波长处的吸光度OD600。 1.2.4 周质空间中α-CGT酶的制备 取一定量菌体的发酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下离心10 min，倒去上清液。用蒸馏水洗涤细胞沉淀2遍，离心（同上）后取2 g左右菌体细胞，按照比例1： 10（m/v）加入对应体积的Tris-EDTA缓冲液混合均匀。细胞悬液使用超声波细胞破碎仪进行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下离心5 min，所得上清液为周质空间中α-CGTase酶活测定液。

1.2.5 α-CGT酶环化活力的测定 甲基橙法测定环化活性：取离心后并适当稀释的发酵上清液100 μL，加入装有900 μL预先用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麦芽糊精溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入1.0 mL浓度为1.0 mol·L-1的盐酸终止反应，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保温15 min，在508 nm处测定吸光度。对应α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol的α-环糊精所需的酶量[9-10]。

2 结果与分析 2.1 单因素试验

从10种微量元素中初步筛选出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+这4种显著因素，分别以不同浓度加入发酵培养基中，以空白为对照，测定酶活，结果如表1所示。

从表1可以看出，4种金属离子在较低浓度情况下都对酶活有一定的提高作用，同时，在所设计的离子浓度梯度中，均发现了峰值。为了得出这4种金属离子的最佳配比浓度，需要做进一步的试验。

2.2 两水平析因实验及结果

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在单因素试验基础上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）软件设计24-2 两水平部分析因试验（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4个因素对基因重组大肠杆菌生长和产酶的影响以及各因素之间的交互作用，以确定影响产酶的显著因素。各因素规范值与实际值的设定水平及试验结果见表2。 3

根据回归分析结果（表3），得到线性回归方程，其中包括FFD试验所有项，如下： 酶活 = -75.9 2 + 37.973 96 X1 + 90 X2 + 80.125 X3 + 63.125 X4 -10.578 1 X1X2-9.015 62 X1X3 -6.171 87 X1X4 -21.75 X2X3-35.166 7 X2X4-22.625 X3X4+ 2.953 125 X1X2 X3 + 4.442 708 X1X2 X4 + 2.671 875 X1X3 X4+ 10 X2X3 X4 -1.609 38 X1X2 X3 X4

其中，X1为MgSO4·7H2O；X2为CaCl2·5H2O；X3为FeSO4·7H2O；X4为MnSO4·H2O。

从表3中可以看出，模型的F值为8.075，P值为0.028 3，且R2为0.988 3，表明此模型有很好的拟合度，方程与实际情况比较相符（99%），回归有效。Mg2+，Fe2+和Mn2+是对重组大肠杆菌表达α-CGT酶有显著影响的3个因素。

通过Design Expert 8.0.5b软件做进一步线性分析得出图1。从图1可以看出，α-CGT酶活力随着Mg2+，Fe2+和Mn2+浓度的增大而上升，其中Mg2+和Mn2+的促进作用较为显著，而Fe2+的影响不大；α-CGT酶的表达与Ca2+浓度呈现负效应。因此，在后续试验中，将针对Mg2+，Fe2+和Mn2+做进一步研究。

2.3 中心组合设计（CCD）和响应面分析（RSM）及结果

由析因试验结果得出，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O为响应面显著的变量，因此围绕以上3个显著影响因子做响应面设计。试验设计见表4，其他因素保留在析因试验中心点值不变。对试验结果进行ANOVA分析（表5），并建立下述二次多项式模型。 利用Design Expert软件对中心组合试验结果进行回归分析，利用前述公式可以得到以下二次多项式模型：

酶活 = 81.004 81+14.523 26X1+28.685 63X2+105.574 9X3-0.307 858X1X2-3.623 93X1X3-6.121 98X2X3-0.670 47X12-2.234 06X22-25.793 6X32

其中X1为MgSO4·7H2O；X2为FeSO4·7H2O；X3为MnSO4·H2O。

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模型相关系数R2 = 0.908 3，即模型和试验拟合度较好，可以较为准确地反映出重组大肠杆菌产α-CGT酶的水平。此外，从表5可以看出，模型的F值为5.52，P值为0.006 7，说明此模型显著。

通过Design Expert 8.0.5b进行二次多元回归拟合，得到二次回归方程的响应面及其等高线，如图2所示。由图2可以得到，发酵培养基微量元素母液最优配比为：MgSO4·7H2O（X1） 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O（X2） 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O（X3） 0.51 mmol·L-1。该模型预测得到的最大酶活值为238.19 U·mL-1。

α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成员，是微生物所产的胞外酶，能够催化4种反应——歧化反应、环化反应、偶合反应和水解反应[1-3]。

天然的CGT酶大部分来自嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和软化芽孢杆菌，而构建的基因工程菌为大肠杆菌[4]。基因工程菌在生长和产酶过程中需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等物质；一些微量元素如钙、铁、锌对酶活性中心或辅酶的生成以及酶激活剂的作用有着重要影响[5-8]。本研究采用单因素实验、两水平析因实验、中心组合设计实验和响应面分析法探讨了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响，并得到优化的配比，为α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产具有一定的指导意义。 1 材料和方法 1.1 材 料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。 1.1.2 试剂 酵母浸出物 （FM818，简称YE）由安琪酵母股份有限公司生产；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生产；其他试剂均为分析纯AR。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂粉16。

液体培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。 1.2 方 法

1.2.1 种子培养 将斜面菌样接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，制备2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 摇床上培养8 h。

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1.2.2 发酵培养 将5 mL种子瓶菌样接入装有100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和180 r·min-1摇床上培养40 h。

1.2.3 菌体生物量的测定 采用分光光度计测定发酵液在600 nm波长处的吸光度OD600。 1.2.4 周质空间中α-CGT酶的制备 取一定量菌体的发酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下离心10 min，倒去上清液。用蒸馏水洗涤细胞沉淀2遍，离心（同上）后取2 g左右菌体细胞，按照比例1： 10（m/v）加入对应体积的Tris-EDTA缓冲液混合均匀。细胞悬液使用超声波细胞破碎仪进行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下离心5 min，所得上清液为周质空间中α-CGTase酶活测定液。

1.2.5 α-CGT酶环化活力的测定 甲基橙法测定环化活性：取离心后并适当稀释的发酵上清液100 μL，加入装有900 μL预先用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麦芽糊精溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入1.0 mL浓度为1.0 mol·L-1的盐酸终止反应，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保温15 min，在508 nm处测定吸光度。对应α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol的α-环糊精所需的酶量[9-10]。

2 结果与分析 2.1 单因素试验

从10种微量元素中初步筛选出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+这4种显著因素，分别以不同浓度加入发酵培养基中，以空白为对照，测定酶活，结果如表1所示。

从表1可以看出，4种金属离子在较低浓度情况下都对酶活有一定的提高作用，同时，在所设计的离子浓度梯度中，均发现了峰值。为了得出这4种金属离子的最佳配比浓度，需要做进一步的试验。

2.2 两水平析因实验及结果

在单因素试验基础上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）软件设计24-2 两水平部分析因试验（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4个因素对基因重组大肠杆菌生长和产酶的影响以及各因素之间的交互作用，以确定影响产酶的显著因素。各因素规范值与实际值的设定水平及试验结果见表2。 3

根据回归分析结果（表3），得到线性回归方程，其中包括FFD试验所有项，如下：

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酶活 = -75.9 2 + 37.973 96 X1 + 90 X2 + 80.125 X3 + 63.125 X4 -10.578 1 X1X2-9.015 62 X1X3 -6.171 87 X1X4 -21.75 X2X3-35.166 7 X2X4-22.625 X3X4+ 2.953 125 X1X2 X3 + 4.442 708 X1X2 X4 + 2.671 875 X1X3 X4+ 10 X2X3 X4 -1.609 38 X1X2 X3 X4

其中，X1为MgSO4·7H2O；X2为CaCl2·5H2O；X3为FeSO4·7H2O；X4为MnSO4·H2O。

从表3中可以看出，模型的F值为8.075，P值为0.028 3，且R2为0.988 3，表明此模型有很好的拟合度，方程与实际情况比较相符（99%），回归有效。Mg2+，Fe2+和Mn2+是对重组大肠杆菌表达α-CGT酶有显著影响的3个因素。

通过Design Expert 8.0.5b软件做进一步线性分析得出图1。从图1可以看出，α-CGT酶活力随着Mg2+，Fe2+和Mn2+浓度的增大而上升，其中Mg2+和Mn2+的促进作用较为显著，而Fe2+的影响不大；α-CGT酶的表达与Ca2+浓度呈现负效应。因此，在后续试验中，将针对Mg2+，Fe2+和Mn2+做进一步研究。

2.3 中心组合设计（CCD）和响应面分析（RSM）及结果

由析因试验结果得出，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O为响应面显著的变量，因此围绕以上3个显著影响因子做响应面设计。试验设计见表4，其他因素保留在析因试验中心点值不变。对试验结果进行ANOVA分析（表5），并建立下述二次多项式模型。 利用Design Expert软件对中心组合试验结果进行回归分析，利用前述公式可以得到以下二次多项式模型：

酶活 = 81.004 81+14.523 26X1+28.685 63X2+105.574 9X3-0.307 858X1X2-3.623 93X1X3-6.121 98X2X3-0.670 47X12-2.234 06X22-25.793 6X32

其中X1为MgSO4·7H2O；X2为FeSO4·7H2O；X3为MnSO4·H2O。

模型相关系数R2 = 0.908 3，即模型和试验拟合度较好，可以较为准确地反映出重组大肠杆菌产α-CGT酶的水平。此外，从表5可以看出，模型的F值为5.52，P值为0.006 7，说明此模型显著。

通过Design Expert 8.0.5b进行二次多元回归拟合，得到二次回归方程的响应面及其等高线，如图2所示。由图2可以得到，发酵培养基微量元素母液最优配比为：MgSO4·7H2O（X1） 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O（X2） 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O（X3） 0.51 mmol·L-1。该模型预测得到的最大酶活值为238.19 U·mL-1。

对最优配比做进一步验证试验，结果表明，α-CGT酶活力达到了221.20 U·mL-1，相比对照组酶活力提高了1.4倍。这说明模型是合理可靠的，因此确定发酵培养基微量元素母液最优

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配比为：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1，CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。 3 结论与讨论

综合以上试验可知，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O对α-CGT酶的产量有一定的影响，通过两水平析因试验分析得出显著影响因子为：MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O。通过对这3个显著影响因子做响应面设计及相关软件分析，确定了微量元素母液最优配比为（mmol·L-1）：MgSO4·7H2O 10.94，FeSO4·7H2O 6.48，MnSO4·H2O 0.51。 需指出的是，使用优化后的发酵培养基[11]加入最优配比的金属元素母液，所得到的酶活力比起对照组仅提高4%。结合本课题研究结果推论得知，造成此结果的原因可能是优化培养基中YE和磷酸盐含量较高，含有丰富的有机氮和PO43-，而微量元素母液中的Mg2+浓度较高，三者在培养基灭菌过程中形成了大量MgNH4PO4·6H2O，实际降低了培养基中三者的浓度。培养基中可利用的有机氮减少，造成OD600降低， PO43-浓度降低，验证组的pH值上升幅度比对照组更大，Mg2+的减少，对α-CGT酶的合成也产生了一定影响。本研究为α-CGT酶的后续研究奠定了基础，并对α-CGT酶的工业生产具有一定的指导作用。 参考文献：

[1] Cheng J， Wu D， Chen S， et al. High-level extracellular production of α-cyclodextrin glycosyltransferase with recombinant Escherichia coli BL21 （DE3）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（8）： 3 797-3 802.

[2] 李兆丰. 软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析[D].无锡：江南大学， 2009.

[3] 吴敬， 顾正彪， 陈坚， 等. 环糊精葡萄糖基转移酶的制备与应用[M].北京： 化学工业出版社， 2011： 3-5.

[4] 王磊. Bacillus clarkii 73γ-环糊精葡萄糖基转移酶的重组表达及其应用[D].无锡：江南大学， 2013.

[5] 李建华， 李啸， 张娅， 等. 金属离子对卤醇脱卤酶发酵生产的影响[J].中国酿造， 2012（3）： 127-131.

[6] Ding R， Li Z， Chen S， et al. Enhanced secretion of recombinant α-cyclodextrin glucosyltransferase from E.coli by medium additives[J].Process Biochemistry，2010，45（6）： 880-886.

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[7] 彭哲， 张嗣良. 中心组合设计优化东方拟无枝酸菌发酵生产万古霉素的微量金属离子[J]. 化学与生物工程， 2011（4）： 65-69.

[8] 宋拓， 李俊俊， 唐湘华， 等. 响应面分析法优化β-环糊精的制备工艺[J].中国酿造， 2013（1）： 84-.

[9] 杨玉路， 王蕾， 陈晟， 等. 重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化[J]. 生物技术通报， 2014（8）： 175-181.

[10] Tesfai B T， Wu D， Chen S， et al. Strategies for enhancing extracellular secretion of recombinant cyclodextrin glucanotransferase in E.coli[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2012， 167（4）： 7-908.

[11] 张江， 李啸， 杜浪. 基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化[J].天津农业科学， 2012（6）： 73-77.

对最优配比做进一步验证试验，结果表明，α-CGT酶活力达到了221.20 U·mL-1，相比对照组酶活力提高了1.4倍。这说明模型是合理可靠的，因此确定发酵培养基微量元素母液最优配比为：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1，CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。 3 结论与讨论

综合以上试验可知，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O对α-CGT酶的产量有一定的影响，通过两水平析因试验分析得出显著影响因子为：MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O。通过对这3个显著影响因子做响应面设计及相关软件分析，确定了微量元素母液最优配比为（mmol·L-1）：MgSO4·7H2O 10.94，FeSO4·7H2O 6.48，MnSO4·H2O 0.51。 需指出的是，使用优化后的发酵培养基[11]加入最优配比的金属元素母液，所得到的酶活力比起对照组仅提高4%。结合本课题研究结果推论得知，造成此结果的原因可能是优化培养基中YE和磷酸盐含量较高，含有丰富的有机氮和PO43-，而微量元素母液中的Mg2+浓度较高，三者在培养基灭菌过程中形成了大量MgNH4PO4·6H2O，实际降低了培养基中三者的浓度。培养基中可利用的有机氮减少，造成OD600降低， PO43-浓度降低，验证组的pH值上升幅度比对照组更大，Mg2+的减少，对α-CGT酶的合成也产生了一定影响。本研究为α-CGT酶的后续研究奠定了基础，并对α-CGT酶的工业生产具有一定的指导作用。 参考文献：

[1] Cheng J， Wu D， Chen S， et al. High-level extracellular production of α-cyclodextrin glycosyltransferase with recombinant Escherichia coli BL21 （DE3）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（8）： 3 797-3 802.

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[11] 张江， 李啸， 杜浪. 基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化[J].天津农业科学， 2012（6）： 73-77.