基于rDNA ITS序列分析Alternaria与相似属的关系及 A. leucanthemi的分类地位
赵国柱1
，2
张天宇1 * 曹爱新2 王洪凯1
（1山东农业大学植物病理学系, 山东泰安 271018）
（2中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室, 北京100080）
摘 要：对Alternaria, Stemphylium, Ulocladium, Nimbya, Embellisia等五个形态相似属的代表性种进行了5.8S/ITS区段序列测定，连同从GenBank下载的相关有性型Pleospora, Lewia的同项资料，由Neighbor-joining方法构建系统发育树。序列对比结果显示，所有参试的菌株/种的5.8SrDNA序列保守程度较高，ITS序列变化较大，ITS1比ITS2变化更大。由5.8S/ITS构建的系统发育树可以足够将供试菌区分到属；系统发育树显示Alternaria，Ulocladium，Nimbya和Embellisia系统学关系较近，又存在一定的分化；Stemphylium聚在相对较远的分支上，与上述四属关系较远，相对独立进化；有性型的Pleospora与无性型的Stemphylium被聚到一个分支，这种不同阶段菌株在遗传基础上的一致，充分证明所用方法及所选测序的rDNA区段对本类群真菌的分类很有价值。Alternaria leucanthemi位于系统发育树的外侧，较为独立进化，与Alternaria的其它种亲缘关系较远，却与Stemphylium spp. 和Bipolaris spp. 关系较近，对其目前的分类地位提出质疑。
关键词 链格孢属,匍柄霉属，假格孢属,埃里格孢属,细基格孢属,系统学
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2006）02-0184-0191
Phylogenetic relationships of Alternaria and related genera and taxonomic status of A. leucanthemi inferred from ITS rDNA sequence analysis
ZHAO Guo-Zhu1, 2 ZHANG Tian-Yu1* CAO Ai-Xin2 WANG Hong-Kai1
(1. Department of Plant Pathology, Shandong Agricultural University, Taian 271018)
(2. Key Laboratory of Systematic Mycology & Lichenology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080)
ABSTRACT: In order to further elucidate the relationships among Alternaria, Ulocladium, Stemphylium, Nimbya and Embellisia and their teleomorphic Pleospora and Lewia, nuclear internal transcribed spacer (ITS) and 5.8SrDNA from these genera/species are determined and compared. Alignment of the 5.8S/ITS of the tested isolates shows that 5.8SrDNA are highly conserved. The ITS sequences, especially ITS1, are very variable in both base composition and length. Phylogenetic analysis of the 5.8S/ITS sequence data sets by NJ (Neighbor-joining) method clearly separated these tested fungi on generic level. The results indicate that Alternaria spp., Ulocladium spp., Nimbya spp. and Embellisia spp. are placed together in a large
基金项目：国家自然科学基金项目 (39899400) 和中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室（915）课题资助 *通讯作者(Corresponding author) E-mail：tyzhang@sdau.edu.cn 收原稿日期：2005-10-26，收修改稿日期：2005-11-23
2期 赵国柱等：基于rDNA ITS序列分析Alternaria与相似属的
关系及A. leucanthemi的分类地位 185
Alternaria-complex clade and are closely related, they are relatively differentiated to some extent; Stemphylium spp. are clustered in a distant clade and phylogenetically distinct from the other four genera, showing a relative independent evolution. The anamorphic Stemphylium spp. and its teleomorphic Pleospora spp. are clustered in a clade. Such a phylogenetic consistency on different genetic phase of strains strongly testifies that using these methods and different analysis regions of rDNA selected are very valuable in studying systematics of these fungi. Based upon 5.8S/ITS sequence identities, Alternaria leucanthemi is obviously different from most Alternaria spp.. It is closely related to Stemphylium spp. and Bipolaris spp., and its present taxonomic status is doubtful. KEY WORDS: Stemphylium, Ulocladium, Nimbya, Embellisia, systematics
链格孢Alternaria Nees及其近似属真菌因分生孢子具有纵横隔膜，呈砖格状，通常统称为砖格丝孢菌（Dictyosporous Hyphomycetes）。主要包括链格孢属Alternaria, 匍柄霉属Stemphylium Wallroth，假格孢属Nimbya E.G. Simmons, 埃里格孢属Embellisia E.G. Simmons, 细基格孢属Ulocladium Preuss等属真菌，其中的许多种是重要的植物病原菌，寄生于多个科的植物上引起病害。
学术界对这几属真菌在形态和常规分类方面虽有不少研究（Simmons，1967，1969，1971，1983，1985，1989，1990，1992，1998，2004；张天宇，2003），但它们之间的系统演化关系一直存在争议。其中Stemphylium的产孢梗为层出式延伸，并形成膨大的产孢环痕，与其它几属不同，但其分生孢子形态与无喙的Alternaria [如白花菊链格孢A. leucanthemi和向日葵链格孢A. helianthi （Hansf.） Tubaki & Nishihara] 非常相似。除Stemphylium外其余四属的分生孢子梗都以内壁芽生孔生方式（eb-tret）产孢，作合轴式（sympodial）延伸，产孢方式基本相同。这种产孢方式上的极为相似，造成仅靠分生孢子形态进行分类的困难和混乱。它们的有性型为子囊菌格孢腔菌目（Pleosporales）的不同属，从有性型的角度说明它们之间既相互联系又有一定的分化。
分子系统学的研究已初步阐明这些属间的系统学关系（Pryor & Gilbertson, 2000; Pryor & Bigelow, 2003）。但一些形态特殊种的分类地位（如Alternaria leucanthemi 和A. helianthi等）缺乏分子证据，尚需进一步验证。本研究在前期形态研究的基础上发现Alternaria leucanthemi在形态及个体发育上与Alternaria的其它种差别很大，而与Stemphylium 和
，从分子角度来论证Bipolaris Shoemaker等蠕形分生孢子真菌相似性很大（张天宇，2003）
它的分类地位十分必要。
真菌的rDNA由于存在高度保守区和可变区被认为是目前真菌分子系统学研究的理想部位，对rDNA的不同区段进行序列分析可以直接看到碱基的变化。这些变化反应在系统发育上非常直观，易于理解。本研究在形态分类的基础上，对选定属、种的rDNA的5.8S/ITS区段进行了序列分析，同时从GenBank中下载相关的有性型，构建系统发育树从分子水平上进行深入研究，理清它们之间的关系，探讨Alternaria leucanthemi的分类地位。
1 材料与方法
1.1 菌种来源（见表1） 1.2 菌体培养
从在PDA平板上培养3天的菌落边缘取2mm×2mm的菌丝块，接种到100ml PD液体培养基中，25℃条件下摇床150rpm震荡培养3天，4层纱布过滤菌体后，用无菌水洗2
186 菌 物 学 报 25卷
次，再用灭菌的生理盐水洗2次，用灭菌的吸水纸吸去水分，-20℃冰箱过夜，备用。 1.3 DNA的提取和纯化
CTAB（Cetyltriethylammonium Bromide）法（参见Edwards et al., 1991略改动）。 1.4 PCR扩增
扩增和测序所用的引物ITS5，ITS4（White et al., 1990），分别由上海基康生物公司和上海申能博彩生物技术公司合成（PAGE纯）。扩增反应在25µL体系，依次加入下列试剂：Buffer（10×）2.5µL；Mg2+（25mmol/L）2µL；ITS5（10pmol/L）0.25µL；ITS4（10pmol/L）0.25µL；4×dNTP（每种2.5mmol/L）2µL；Taq酶（3u/µL）1u；模板DNA 1µL（20~50ng）；dd.H2O 16.7µL。在美国MJ Research公司生产的PTC-200 PCR仪上按下列程序：95℃预变性3min；然后94℃变性40S，50℃退火60S，72℃延伸60S，共进行30 cycles；最后72℃延伸10min。
扩增产物用1%的琼脂糖凝胶，1×TAE为电泳缓冲液，5V/cm电压，上样4µL电泳检测，设不加摸板DNA的扩增产物为阴性对照，DNA Marker指示分子量，凝胶成像仪观察并照相。
1.5 扩增产物纯化检测
用上海生工生物工程公司的UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒按说明书的要求实行对扩增产物的纯化。纯化产物上样4µL（1%的琼脂糖凝胶，1×TAE为电泳缓冲液，5V/cm电压）电泳检测纯化样品纯度（通常以上样2µL在紫外灯下可见整齐单一条带，即达到测序要求）。
1.6 序列测定和系统发育树的构建
经纯化的PCR产物直接送上海申能博彩生物技术公司，用美国PE公司生产的377型DNA测序仪进行序列测定。正向引物ITS5（5’→3’）进行测定，对正向无法测通的片段用反向引物ITS4，（3’→5’）再测，反向序列经BioEdit version 5.0.6 (Hall, 1999) 软件反向（reverse）互补后与正向序列进行连接形成5’→3’完整序列。将所测序列输入BioEdit软件中，用Clastalw进行序列对准（Alignment），对所有序列进行对准前均需进行序列判读以减少读序的错误。
从GenBank下载的序列先根据扩增序列归类，再输入BioEdit软件进行比对。对于同一种序列，如果和大多数序列相差太多则作为错误序列加以排除；对于同一个种的序列，如果和大多数序列相差不多，但和其它该种的序列相差太多，则作为疑难种进行标记。
用MEGA version 3.0 （Kumar et al., 2004）中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系统树，用Bootstrap对系统树进行检验，1000次重复，玉蜀黍平脐蠕孢Bipolaris maydis和麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana设为外群。
2 结果与分析
2.1 序列比对
所有参试菌株均扩增出分子量大约600bp左右的片段。根据GenBank中收录的绝大部分该类群真菌的5.8S/ITS区的比对结果，整个5.8S/ITS的实际长度在480~522bp之间，因为ITS5引物的结合位点在18SrDNA的3’端，距离ITS1区大约有50个碱基（包括引物结合区），而这一部分区段在真核生物中几乎是高度保守，由于测序仪自身的缘故在每一反应最初的10-40个左右的碱基无法读出，而这一部分恰好是引物结合的高度保守的18SrDNA的3’区, 去掉这一部分区段，对测序结果的分析基本无影响。同样，ITS4引物
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关系及A. leucanthemi的分类地位
表1 用于5.8S/ITS序列分析的菌株来源
Table 1 Fungal isolates for rDNA sequences
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编号Number 标本编号of strains
Specimens
种名 (Species) 基质/寄主Habitats/Host 5.8S/ITS
GenBank No.
NS3 HSAUPII02524 Nimbya scirpicola (Fuckel) E.G. Simmons禾本科Gramineae AY359887
AY372674
E.G. Simmons & Alcorn1
NA4 XMM N. alternanthera (Holcomb & Antonop.) 空心莲子草Alternanthera
philoxeroides (Mart.) Griseb.
NA6 HSAUPII02670 NA8 HSAUPII02798 SG9 HSAUPII0944 NC10 HSAUPII04055 BS11 HSAUPII02486
N. alternanthera (Holcomb & Antonop.) 空心莲子草Alternanthera E.G. Simmons & Alcorn
philoxeroides (Mart.) Griseb.
AY372688
N. alternanthera (Holcomb & Antonop.) 空心莲子草Alternanthera E.G. Simmons & Alcorn
philoxeroides (Mart.) Griseb.
Stemphylium globuliferum (Vestergr.) E.G. 红车轴草Trifklium Simmons
N. celosiae E.G. Simmons & Holcomb
Leguminosae Linn.
AY372689
AY372675
鸡冠花Celosia cristata Linn. AY372676
Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker2腐麦秆Triticum aestivum Linn. AY372677
AY372678 AY372679
EA21 HSAUP991504 Embellisia allii (Campan.) E.G. Simmons大蒜Allium sativum Linn. SN22 HSAUPII02686 UB27 HSAUPII0723
S. nabarii Sarwar Ulocladium botrytis Preuss
番茄Lycopersicum esculentum Mill.
辣椒Capsicum annuum Linn. 玉米Zea mays Linn. 百日菊Zinnia elegans Jacq. 锦葵Malva sylvestris Linn.
AY372680 AY372681 AY372682 AY372683
UB32 HSAUP98249 Ulocladium botrytis Preuss AZ33 HSAUP992053 Alternaria zinniae M.B. Ellis UA36 HSAUPII02365 AL42 HSAUPII04534 AD46 HSAUPII02021 AB57 HSAUPII03031 BM32 HSAUPII02697 EGS 36-103
U. atrum Preuss A. leucanthemi Nelen
向日葵Helianthus annuus Linn. AY372684
AY372685
A. daturicolaT.Y. Zhang, G.Z. Zhao & M. 曼陀罗Datura stramonium Zhang
A. brassicae (Berk.) Sacc. Shoemaker2
Embellisia eureka (E.G. Simmons) E.G. Simmons3
Lewia infectoria (Fuckel) M.E. Barr & E.G. Simmons3
Pleospora herbarum (Pers.) Rabenh.3 Stemphylium botryosum Sacc.3 Pleospora herbarum (Pers.) Rabenh.3 Ulocladium botrytis Preuss3 Ulocladium atrum Preuss3 Alternaria leucanthemi Nelen A. alternata (Fr.: Fr.) Keissl.3 A. alternata (Fr.: Fr.) Keissl.3
Linn.
白菜Brassica chinensis Linn.
AY372686
Bipolaris maydis(Y. Nisik. & C. Miyake) 玉米Zea mays Linn. AY372687
未知Unknown AF3929893 未知Unknown AF2294803 未知Unknown AF0713453 未知Unknown SBY170683未知Unknown AF4427863 未知Unknown AF2294873 未知Unknown AF2294863 向日葵Helianthus annuus Linn. AF314586 未知Unknown AY7514563未知Unknown AY6250563
ATCC 12054
EGS 08-069
ICMP 5620-77 EGS 30-181.1 ATCC 18043 ATCC 18040
XR1 EGS 34-016 ATCC 13963
注：1由向梅梅提供；2由邓晖提供；3 GenBank下载序列；其余菌株由作者分离、鉴定
Notes: 1. Presented by M. M. Xiang. 2. Presented by H. Deng. 3. Sequences from GenBank. The others were isolated by the authors
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的结合区位于28SrDNA的5’端30个碱基左右, 也不考虑在内。所有参试菌株连同GenBank中下载的序列，比对后，取全长621bp（包括部分缺失序列）序列进行分析。5.8S/ITS的序列比对结果显示：所有参试菌株/种该区段的实际长度为481-512bp，其中Embellisia allii (EA21) 在所有参试菌株中序列最长为512bp, Ulocladium botrytis（UB32）和Ulocladium atrum（UA36）最短均为481bp；ITS区变化较大，而5.8S rDNA保守程度非常高，ITS1的全长在152~192（166）bp之间，包含多个变化（indel）位点。5.8S rDNA全长在156bp左右，保守程度高，基本无变化位点。ITS2全长在165bp左右，ITS1区比ITS2区具有更多的可变位点，这似乎预示着ITS1在进化上较ITS2区更快，发生在种级水平上的变异更加明显，而ITS2用于属级分类水平似乎更可靠。所有参试菌株的5.8S/ITS rDNA序列相似性均大于50%，平均在80%-90%，表明它们在自然演化上亲缘关系较近, 同属不同种间相似性明显大于属间相似性，与形态鉴定结果基本吻合。 2.2 系统发育分析
对Alternaria 等个相似属连同有性型相关属Pleospora Rabenh. ex Ces. & de Not
构建5.8S/ITS （Stemphylium的有性型）， Lewia Barr & E.G. Simmons（Alternaria的有性型）
rDNA系统发育树（图1 ），系统发育树可以明显将供试菌分成四个大组：由蠕形分生孢子真菌Bipolaris spp. 构成的外群组；Alternaria leucanthemi 单独构成一组，与其它组相比碱基变异速率最快；Stemphylium 及其有性型Pleospora 分在一组；而其余的Alternaria spp. 及其有性型Lewia，连同Nimbya，Ulocladium，Embellisia 构成一个大的Alternaria-complex 复合组。
Alternaria复合组内又可细分成几个亚组，其中最明显的亚组包括Nimbya 组和Ulocladium组。Nimbya组中除了N. scirpicola（NS3）被排除在分支之外，其余种/菌株N. celosiae (NC10)，N. alternanthera（NA4），N. alternanthera（NA6），N. alternanthera（NA8）被聚到一起，支持率 (Bootstrap) 达77 % 以上；不同地理来源的三株N. alternarthera位于Nimbya分支的内侧，而该属的另外一种N. celosiae则位于分支外侧，说明地理来源的不同对该属种内的分化影响不大，与种间可以明显区别。同时说明5.8S/ITS区序列分析，适合于种间的系统分析。在Ulocladium组中除U. botrytis（UB27）外，其余的两个种四个菌株被聚在一起支持率高达100 %，说明它们之间亲缘关系非常近。除Alternaria leucanthemi外，供试的Alternaria种被分在两个组的外侧，大孢子种的A. brassicae，A. daturicola 和A. zinniae被聚到Ulocladium组的外侧，支持率在50% 以下，而小孢子种的A. alternata (Alternaria的模式种) 却与Nimbya组更接近，但支持率也小于50%。Embellisia eureka，E. allii和N. scirpicola（NS3）在与Alternaria的有性型Lewia infectoria构成的分支中支持率均不高。分支的支持率不高分析原因可能是参选菌株较少，未能提供足够的信息。
系统发育树也初步表明Alternaria可能为多系起源，并且与其形态相似属Nimbya，Embellisia，Ulocladium系统关系更接近，而与Stemphylium关系较远。Stemphylium在系统发育树上明显不同于Ulocladium, Alternaria, Nimbya 和Embellisia 四属，较为独立进化,这于形态上Stemphylium层出式的产孢梗，布袋形的分生孢子明显不同于上述四属十分吻合。
两株A. leucanthemi，AL43与XR1（AF314586）序列高度一致，在系统树上被聚到一起并获得100%的支持率，而其没有聚在Alternaria分支中，却与Stemphylium和Bipolaris更为接近，但又存在一定的分化，分析与它们形态上的相似性有密切联系。
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关系及A. leucanthemi的分类地位
100
B. sorokiniana BS11 B. maydis BM32
outgroup
100 A. leucanthemi AL42
189
A. leucanthemi AF314586
100
S. nabarii SN22 S. globuliferum SG9 P. herbarum AF071345 P. herbarum AF442786
N. scirpicola NS3
L. infectoria AF229480
94
52 E. eureka AF392989 E. allii EA21
99 N. alternanthera NA4 N. alternanthera NA6 99
77 N. alternanthera NA8
N. celosiae NC10 A. alternata AY625056 100 A. alternata AY751456 96 A. daturicola AD46 A. zinniae AZ33 A. brassicae AB57 U. botrytis UB27 U. atrum UA36 U. botrytis AF229487 100 U. botrytis UB32
U. atrum AF229486
0.02
Ulocladium
A.= Alternaria
B.= Bipolaris E.= Embellisia L.= Lewia N.= Nimbya P.= Pleospora S.= Stemphylium U.= Ulocladium Alternaria complex
Stemphylium
70 S. botryosum SBY17068
Nimbya
99 图1 由NJ方法构建5.8S/ITS的系统发育树
Bipolaris spp. 作为外群，比例尺显示水平线的长度，代表碱基替换数；分支处数字为大于50％的Bootstrap值（1000次重复），代表分类单位被聚在一起的几率 （%）
Fig.1 Phylogenetic tree obtained from the program NJ (Neighbor-joining). The tree was rooted with Bipolaris maydis and B. sorokiniana. Horizontal branch lengths are drawn to scale and represent the expected number of substitutions. The numbers of nodes are bootstrap values greater than 50% frequencies and represent the percentages of 1000 bootstrap replications in which the taxa to the right are placed together by the program NJ.
3 讨论
在丝孢菌Hyphomycetes的形态分类上，产孢方式（Sporulation pattern, 包括分生孢子的形成方式和产孢梗/细胞的延伸方式）结合分生孢子的形态特征作为划分属及以上分类群
190 菌 物 学 报 25卷
的主要依据，被很好的体现在Alternaria等五个相似属的分类中。Stemphylium 的分生孢子梗以层出的方式作环痕式（ann）延伸，分生孢子长椭圆形，布袋形，多单生（Wiltshire, 1938；Simmons，1967），而其余四属真菌产孢梗合轴式（sym）延伸，孔生式（tret）产孢，分生孢子形状不同（Ellis, 1971, 1976）。从形态上说明Stemphylium相对独立的进化过程，这一结果我们在分子水平上得到证实。Nimbya由Simmons（1989）从Alternaria中组合建立,他认为该属真菌产生典型的假隔膜，从而将许多原属于Alternaria的分生孢子具有假隔膜的种组合至Nimbya中。Embellisia虽然与Alternaria，Ulocladium，Nimbya具有相同的产孢梗延伸方式，但因其粗而厚的分生孢子隔膜被Simmons（1971）从原Helminthosporium中独立建属，而Ulocladium因分生孢子尖端与产孢梗相连而区分于Alternaria。但Alternaria, Nimbya, Embellisia 和Ulocladium, 及蠕形分生孢子真菌的Bipolaris的区分主要建立在分生孢子的形态上。我们的研究表明建立在产孢方式上对属（Stemphylium）的划分比建立在分生孢子形态上对属（Alternaria, Nimbya, Embellisia 和Ulocladium）的划分更为合理，在系统树上遗传距离较远，而Alternaria-complex组的各属成员关系较近。
有性型（Teleomorph）在真菌的遗传演化中占有重要的地位，可以帮助解决无性型真菌的分类和系统学关系，有性型－无性型相互联系也是真菌分类的理想结果。Jasalavich et al. (1995) 对Alternaria alternata, A. brassicae, A. brassicicola, A. raphani 及Pleospora herbarum（Stemphylium的有性型）五种各一个菌株的18SrDNA，5.8SrDNA基因及ITS1，ITS2进行序列分析，发现4种链格孢的5.8SrDNA序列完全相同，与P. herbarum（枯叶格孢腔菌）仅有一个碱基的差异。ITS1在碱基组成及片段长度上都有较大差异，18SrDNA序列则高度保守，但可以明确的区分属，所有参试Alternaria之间亲缘关系很近。这是有关Alternaria rDNA序列的首例报道。但在目前的Alternaria类群中极少发现有性型。我们的研究结果在5.8S/ITS系统分析上对Alternaria得到有效区分与Jasalavich et al.（1995）的结果基本一致，同时也说明Pleospora作为Stemphylium的有性型位置。而Lewia由于参选资料的缺乏其系统学位置尚需进一步研究。
由于形态上的相似性和许多有性型的未知，对于Alternaria及其相似属的研究越来越多的集中到对无性型的DNA序列分析上。Pryor & Gilbertson（2000）对Alternaria, Stemphylium和Ulocladium的ITS/5.8S和18SrDNA线粒体小亚基SSUrDNA的序列进行分析，将这三个属从分子角度进行了区分，证明Ulocladium和Alternaria亲缘关系较近，而Stemphylium与上两属关系较远，与我们对5.8S/ITSrDNA的系统发育结果相一致。陈伟群（1997）对Alternaria等相似属的ITS/5.8S序列分析表明，几个相似属得到有效区分。近期的分子研究也表明Embellisia和Nimbya为Alternaria 和Ulocladium的姊妹群，它们与Alternaria的关系较Stemphylium 的更近（Pryor & Bigelow, 2003）。我们的研究结果和以上学者的研究结果都证明5.8S/ITSrDNA在研究该类群真菌属和种级水平上是有意义的，可以明显将供试菌在属级水平上分开，并且这一结果与Simmons等，在形态上的鉴定结果基本一致，从而有力的支持了形态学的分类观点。
Alternaria leucanthemi和A. helianthi是生于菊科植物向日葵上的重要病原菌，形态相似，为单芽生产孢、长椭圆形、无喙的分生孢子。无论在形态上还是在产孢表型上都与Alternaria的其它种相差很大，但对其分类地位一直以来都未引起人们的重视，也缺乏相关的分子证据。我们的rDNA序列分析结果显示A. leucanthemi与Alternaria的其它种序列差异较大，在系统发育树上也与Alternaria的大部分种相距甚远，与Stemphylium和Bipolaris
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较为接近，对其目前的形态分类位置提出质疑。结合形态研究结果，建议将Alternaria leucanthemi及A. helianthi独立为新属，但由于A. helianthi的分子资料尚缺乏，进一步的研究需要获得这两种的模式材料再做定论。 [REFERENCES]
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[附中文参考文献]
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