山东医药２０１２年第５２卷第２７期 ・基础研究・ 康脑液对脑缺血大鼠５一溴脱氧尿嘧啶 核苷及巢蛋白表达的影响 耿倩 ，马倩 ，邹玉安 ，薛茜 （１河北北方学院，河北张家口０７５０００；２河北北方学院第一附属医院） 摘要：目的进一步探讨康脑液治疗缺血性脑血管病（ＩＣＶＤ）的可能机制。方法将１２０只雄性ＳＤ大鼠随机 分为假手术组、模型组及康脑液高、中、低剂量组各２４只，五组均于术前７ ｄ开始灌胃，其中康脑液高、中、低剂量组 分别予２４、１２、６ ｇ／（ｋｇ・ｄ）康脑液，假手术组及模型组给予等量蒸馏水，１ ０：／ｄ、直至处死；模型组及康脑液各组均 以线栓经右侧颈外动脉插线法建立右侧大脑中动脉闭塞（ＭＣＡＯ）模型，假手术组仅切开动脉、不阻断；术后２４ ｈ五 组均开始腹腔注射５－溴脱氧尿嘧啶核苷（Ｂｒｄｕ）溶液５０ ｍｇ／ｋｇ，１次／ｄ、直至处死。缺血再灌注后３、７、１４、２１ ｄ采用 免疫组化检测各组ＢｒｄＵ、巢蛋白（Ｎｅ￣ｉｎ）表达。结果假手术组大脑皮质、海马部位有少量ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ阳性细 胞；余四组再灌注７ ｄ时Ｂｒｄｕ、Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞开始增多，１４ ｄ达高峰、２１ ｄ开始下降，但各时间点均显著高于假手 术组（Ｐ＜０．０５或０．０１）；与模型组比较，康脑液各组Ｂｒｄｕ阳性细胞数量在再灌注后各时间点均显著升高（Ｐ＜０．０５ 或０．０１），Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞数量在再灌注后７、１４、２１ ｄ显著升高（Ｐ＜０．０５）。结论关键词：康脑液；缺血再灌注；神经干细胞；增殖 中图分类号：１１７４３．３１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２￣６６Ｘ（２０１２）２７－００３０￣３ 康脑液可通过上调Ｂｒｄｕ、Ｎｅｓ ｔｉｎ表达促进脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖，此为其治疗ＩＣＶＤ的重要机制之一。 在中国，脑卒中是仅次于癌症的第２位杀手，是 仪器：电脑生物组织包埋机（浙江金华科迪仪器公 司），石蜡切片机（美国Ｔｈｅｒｉｎｏ），电脑生物组织摊片 威胁中老年人生命健康的常见神经系统疾病，其中 缺血性脑血管病（ＩＣＶＤ）占５６．６％～８０％，患者总 人数达５００万～６００万，存活者致残率最高达约 ７５％…。ＩＣＶＤ的防治已成为目前研究重点。２０１１ 烤片机（浙江金华科迪仪器公司），光学显微镜（日 本ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ６０型），显微摄影装置（日本ＮＩ— ＫＯＮ）。 年４月，我们观察了康脑液对脑缺血再灌注大鼠内 源性神经干细胞（ＮＳＣ）增殖的影响，旨在为康脑液 防治ＩＣＶＤ提供理论依据。 １材料与方法 １．２动物分组及处理将１２０只ＳＤ大鼠随机分 为假手术组、模型组及康脑液高、中、低剂量组，每组 ２４只。五组均于术前７ ｄ开始灌胃，其中康脑液高、 中、低剂量组分别予２４、１２、６ ｇ／（ｋｇ・ｄ）康脑液，假 手术组及模型组给予等量蒸馏水，１次／ｄ、直至处 死。模型组及康脑液各组均根据Ｌｏｎｇａ等研究，以 线栓经右侧颈外动脉插线法建立右侧大脑中动脉闭 塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｅｅｒｅｂｒａｌ ａ￣ｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）模型，假 １．１实验材料①实验动物：健康雄性ＳＤ大鼠 １２０只，体质量２００～２７０ ｇ，ＳＰＦ／ＵＡＦ级，购自北京 大学医学部实验动物科学部［许可证号ＳＣＸＫ（京） ２００６－０００８］。②药品及试剂：康脑液饮片（河北北方 学院第一附属医院），冷水浸泡一夜，煎煮２次，滤 出药渣，将２次煎煮的药液混匀，文火分别浓缩成 手术组仅切开动脉、不阻断。术后２４ ｈ五组均开始 腹腔注射ＢｒｄＵ溶液５０ ｍｇ／ｋｇ，１次／ｄ、直至处死。 １．３脑组织取材及ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ表达检测①脑 ４００％、２００％、１００％康脑液（每毫升分别含生药４、 ２、１ ｇ），置４℃冰箱保存备用；５一溴脱氧尿嘧啶核苷 （ＢｒｄＵ，南京探求生物技术有限公司）粉剂（按１０ ａｒｇ／ｍＥ溶解于生理盐水中），兔抗鼠巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ） 抗体（镇江厚普生物科技公司），鼠抗尿嘧啶脱氧核 组织取材：分别于缺血２ ｈ再灌注后３、７、１４、２１ ｄ各 取６只处死取材：腹腔注射１０％水合氯醛麻醉，经 左心室插管至升主动脉，灌注肝素化生理盐水３００ ｍＬ，４％多聚甲醛灌注固定３０ ｍｉｎ，快速断头取脑， 以视交叉为中线将脑组织切成厚度２～３ ｍｍ的组 苷单克隆抗体（北京中山生物技术公司）。③实验 基金项目：河北省卫生厅课题基金资助项目（２００９０５９１）。 ３０ 织块，４％多聚甲醛液固定，常规石蜡切片，切片厚度 为３ ｍ。②ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ表达检测：采用免疫组化 代受损或缺失的神经元，实现自我修复。因此，利用 神经细胞因子或药物等增强脑内源性ＮＳＣ自我更 替和修复能力可能是一种新的脑部疾病治疗途径， 为ＩＣＶＤ的治疗提供了新的思路。中医认为，脑卒 中发生主要是由于气虚血瘀所致，治疗原则以益气 活血化瘀为主。目前研究发现，黄芪 Ｊ、川芎 等 单味中药的某些成分和复方芪棱汤 Ｊ、通心络 Ｊ、 补阳还五汤 等均能促进神经再生。康脑液为临 床经验方，由益气活血的鼻祖方补阳还五汤按照现 代人的特点化裁而来，由黄芪、丹参、川芎、葛根、钩 藤、三七等组成，临床用于治疗ＩＣＶＤ具有较好疗 效。 ＢｒｄＵ是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，ＮＳＣ发生 增殖后可作为底物参与ＤＮＡ合成，被视为细胞 增殖的标记。已有研究表明，脑缺血可促进大脑皮 质、海马等处ＮＳＣ增殖、迁移和分化 卜 ，且ＮＳＣ增 殖也有一定规律性，即神经再生并不是在脑缺血后 短期内增强的，其再生能力在第１０天左右达到峰 值 １ｏ］。Ｎｅｓｔｉｎ是ＮＳＣ内一种特殊的中问丝蛋白，被 视为其特异性标记蛋白【１１，１２］，其Ｃ末端大量的丝氨 酸可能是磷酸化位点，丝氨酸的磷酸化可能影响 Ｎｅｓｔｉｎ与其他细胞骨架的结合。因此，Ｎｅｓｔｉｎ很可能 是一种自我保护性蛋白，有利于细胞存活及细胞骨 架的稳重和重建，其重新表达在缺血脑周围可能增 加脑组织的抗缺血能力，从而有利于神经系统功能 的恢复。本研究显示，假手术组大脑皮质、海马部位 有少量ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞；余四组再灌注７ ｄ时 ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞开始增多，１４ ｄ达高峰、２１ ｄ 开始下降，但各时间点均显著高于假手术组；与模型 组比较，康脑液各组ＢｒｄＵ阳性细胞数量在再灌注 后各时间点均显著升高，Ｎｅｓｔｉｎ阳性细胞数量在再 灌注后第７、ｌ４、２１ ｄ显著升高。提示康脑液可通过 ３２ 山东医药２０１２年第５２卷第２７期 上调ＢｒｄＵ、Ｎｅｓｔｉｎ表达促进脑缺血损伤后内源性 ＮＳＣ增殖，此为其治疗ＩＣＶＤ的重要机制之一；但上 调的确切机制尚不清楚，有待于进一步研究。 参考文献： ［１］Ｊｉａ Ｑ，Ｌｉｕ ＬＰ，Ｗａｎｇ ＹＬ．Ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１０，３７（２）：２５９． ［２］王畅，张艳军，冯英，等．黄芪甲苷对短暂性前脑缺血模型大鼠海 马神经再生的影响［Ｊ］．中草药，２００９，４０（５）：７５４－７５８． ［３］王锁良，申小东，王辉，等．川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后 ＧＦＡＰ表达和脑组织水肿的影响［Ｊ］．神经解剖学杂志，２００９，２５ （４）：４２７－４３１． ［４］周荣峰，赵喜连，邓茜，等．芪棱汤对脑缺血后神经干细胞增殖分 化作用的研究［ｊ］．中国中医急症，２００９，１８（１０）：１６５０－１６５１． ［５］尹瑞雪，王立新，范建中．通心络对脑缺血再灌注损伤后大鼠内 源性神经巢蛋白和碱性成纤维生长因子表达的影响［Ｊ］．新乡 医学院学报，２０１０，２７（１）：ｌ－４． ［６］韩玉生，周忠光．补阳还五汤对ＡＩ３１＿４Ｏ所致老年性痴呆大鼠海 马区Ｂ淀粉样前体蛋白及相关基因表达的影响［Ｊ］．时珍国医 国药，２００９，２０（１）：９－ｌ１． ［７］Ｚａｕｓｉｎｇｅｒ Ｓ，Ｈｕｎｇｅｒｈｕｂｅｒ Ｅ，Ｂａｅｔｈｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍ— ｐａｉｒｍｅｎｔ ｉｎ ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ—ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ：ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐａｒａｄｉｇｍｓ［Ｊ］．ＢｒａｉｎＲｅｓ， ２０００，８６３（１－２）：９４—１０５． ［８］陈虎，蔡定芳．内源性神经干细胞与脑缺廊后的神经再生［Ｊ］． 国外医学：脑血管疾病分册，２００２，１０（５）：３６７－３６９． ［９］Ｈｏｌｍｉｎ Ｓ，ｖｏｎ Ｇｅｒｔｔｅｎ Ｃ，Ｓａｎｄｂｅｒｇ—Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ＡＣ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｎｅｓｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｌ Ｊ］．Ｎｅｕ— ｒｏｓｃｉｌｅｔｔ，２００１，３１４（３）：１５１－１５５． ［１０］Ｐａｒｅｎｔ ＪＭ，Ｖｅｘｌｅｒ ＺＳ，Ｇｏｎｇ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒａｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏ・ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｉａｔｌａ ｎｅｕｒｏｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｆｏｃａｌ ｓｔｏｒｋｅ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ， ２００２，５２（６）：８０２－８１３． ［１１］韩肖华，黄晓琳．电针督脉腧穴对脑缺血大鼠缺血灶周围巢蛋 白表达的影响［Ｊ］．华中科技大学学报（医学版），２０１０，３９（３）： ３８３－３８６． ［１２］Ｇｉｌｙａｒｏｖ ＡＶ．Ｎｅｓｔｉｎ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｂｅｈａｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，３８（２）：１６５—１６９． （收稿日期：２０１２－０３－２２）
