108
2019年11月
食品科学技术学报JournalofFoodScienceandTechnology
Vol.37No.6Nov.2019
doi:10.3969/j.issn.2095鄄6002.2019.06.015文章编号:2095鄄6002(2019)06鄄0108鄄08引用格式:刘珊珊,刘亚琼,张琦,等.双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究[J].食品科学技术学报,2019,37
(6):108-115.
LIUShanshan,LIUYaqiong,ZHANGQi,etal.Optimizationofsynergisticenzymatichydrolysisofpolysaccharideextractionfromdandelionrootandstudyonitsantioxidantactivity[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2019,37(6):108-115.
双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究
刘珊珊,摇刘亚琼*,摇张摇琦,摇路摇瑶
(河北农业大学食品科技学院,河北保定摇071001)
摘摇要:以蒲公英根烘焙粉为原材料,研究了酶添加量、酶解温度和酶解时间在单酶和双酶协同酶解条件下对多糖得率和DPPH自由基清除率的影响,并采用响应曲面法优化了酶解工艺参数。结50益,酶添加量1郾0mL;木瓜蛋白酶酶解温度60益、酶添加量2郾0mL。双酶法多糖提取率高于单酶法,影响多糖得率的工艺因素主次顺序为酶解时间、酶解温度、酶添加量。适宜的多糖提取条件为:料水比(g颐mL)1颐30,木瓜蛋白酶悬液(200U/mL)添加量1郾98mL,纤维素酶悬液(200U/mL)92郾31%依0郾25%。烘焙和酶解工艺可提高蒲公英根多糖得率和DPPH自由基清除率。关键词:蒲公英根;多糖;纤维素酶;木瓜蛋白酶;协同酶解;DPPH自由基中图分类号:TS201郾1摇摇摇摇摇文献标志码:A摇摇蒲公英(TaraxacummongolicumHand.鄄Mazz.),菊科,为多年生草本植物,种类繁多,营养价值和药用价值高,资源丰富。蒲公英的叶、花、根均可食用,2012年被国家卫生部列入《既是食品又是药品的物品名单》。
(PIS)等多种生理活性成分[2-3],具有抗氧化[4]、抗癌[5]、抗炎[6]等多重有益生理作用。蒲公英根多糖含量丰富,目前多糖提取常用的方法有:传统热水浸提法、超声辅助提取法、酶提取法等[7-8]。酶解法不仅能提高多糖得率,还有助于保持多糖的活性,因而受到广泛关注。已有报道采用木瓜蛋白酶对蒲公英进行酶解,多糖得率为3郾08%,优于传统的热水提取;亦有使用纤维素酶提取蒲公英多糖,得率达
收稿日期:20180607
基金项目:河北农业大学大学生科技创新重点扶持计划项目(2017zd);河北省“国家一流学科食品科学与工程冶建设项目(1036004)。摇*通信作者:刘亚琼,女,副教授,博士,主要从事农产品加工与贮藏方面的研究。
第一作者:刘珊珊,女,硕士研究生,研究方向为食品加工与安全。
果表明,单酶法提取1g蒲公英根多糖的适宜条件为:料水比(g颐mL)1颐30,纤维素酶酶解温度
添加量0郾99mL,55益提取1郾9h,此时多糖得率为32郾97%依0郾13%,DPPH自由基清除率为
20郾67%[9-10]。上述研究均为单酶法提取多糖,有研究显示,复合酶提取法能有效提高多糖提取见报道。
率[11],但将该方法应用在蒲公英根多糖的提取尚未
本研究拟以烘焙后的蒲公英根粉为原料,采用木瓜蛋白酶-纤维素酶双酶协同提取蒲公英根多糖,并通过响应面试验对蒲公英根粉酶解工艺参数进行优化,以期为蒲公英根多糖提取提供新的思路,促进蒲公英产业发展。
用于制作沙拉、保健茶、酿酒及咖啡替代品等[1],
蒲公英根含有多糖、黄酮、4鄄羟基苯乙酸肌醇酯
1摇材料与方法
1郾1摇材料与试剂
(400U/mg),北京奥博星生物技术有限责任公司;木瓜蛋白酶(50万U/g),上海源叶生物科技有限公司;重
蒲公英根粉(80目),试验室自制;纤维素酶
第37卷第6期摇摇摇摇摇摇摇刘珊珊等:双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究109
蒸酚、1,1鄄二苯基鄄2鄄三硝基苯肼(DPPH),北京索莱宝1郾2摇仪器与设备
科技有限公司;无水乙醇、浓硫酸均为分析纯。
AR423CN型电子天平,奥豪斯仪器(上海)有限
8郾05软件设计三因素三水平Box鄄Behnken响应面试得到各实验因素与响应值之间函数关系的回归方程,根据响应面图确定适宜的酶解工艺条件。
Tab.1摇Independentvariablesandtheirlevelsin
responsesurfacedesign
A
B
水平-1C酶解时间/h
1郾5
验,试验方案如表1。通过二次多元回归方程拟合,
公司;H.SWX-600BS型电热恒温水温箱,金坛市朗博仪器制造有限公司;C20-SH2040型美的多功能
表1摇响应面设计中的自变量及其水平
电磁炉,美的集团股份有限公司(广东);PAL-琢型手持糖度计,ATAGO(爱拓)中国分公司;UV2200型紫1郾3摇实验方法
外可见分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
酶添加量/mL
0郾5
酶解温度/益
50
1郾3郾1摇酶解工艺实验
酶解工艺流程:取1郾00g蒲公英根粉,加定量水,加酶水浴酶解,沸水浴灭酶5min,流水快速冷却至室温,用300目滤布过滤得酶解液。
蒲公英根粉制备:蒲公英根粉碎过80目检验筛,120益烘焙35min,每10min翻动一次,防止焦煳。酶液配制:木瓜蛋白酶液酶活200U/mL,纤维素酶液酶活200U/mL,4益保存待用。
1郾1郾3郾3郾2摇2郾单因素实验
按1摇1郾3郾单酶酶解实验
1实验操作,分别进行纤维素酶、木瓜蛋
1颐白酶酶解实验,设料水比(g颐mL)为1颐10、1颐20、
1郾30、1颐40、1颐50(酶添加量1郾0mL,60益酶1颐5别为30,h),0、0郾酶添加量酶解温度为5、1郾0、2郾1郾00、3郾mL,30、40、50、60、700、4郾酶解01郾mL(5h),料水比为酶液添加量分益(料水比为解1颐30,
木瓜蛋白酶处理组50益酶解1郾5h,纤维素酶处理组60益酶解1郾5h),测定酶解液多糖得率、可溶性固形物含量和DPPH自由基清除率,确定适宜的料1郾水比3郾2郾、酶解温度和酶液添加量按2摇1郾3郾双酶协同作用与酶解效果实验。
1实验操作,料水比为1颐30,加入纤维
4素酶液mL(501益mL,酶解设木瓜蛋白酶液添加量为1郾5h),酶解温度设置为0、1、2、3、
6050、55、0郾5、1郾益(木瓜蛋白酶液0、1郾5、2郾0、2郾5、3郾2mL,0酶解h(木瓜蛋白酶液1郾5h),酶解时间为酶解温度55益)。测定酶解液多糖得率、可溶性固2mL,形物含量和DPPH自由基清除率,确定适宜的酶添加量、酶解温度和酶解时间。
1郾3郾3摇响应面试验设计
根据单因素实验结果,利用双酶协同提取蒲公英根多糖,选取酶添加量、酶解温度、酶解时间为实验因素,以多糖含量为响应值,通过DesignExpert01
1郾1郾05
5560
2郾2郾05
1郾4摇理化指标测定
1郾4郾1摇可溶性固形物含量测定使用手持糖度计测量溶液的可溶性固形物含量。1郾4郾2摇多糖含量测定
采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[9]葡萄糖标准曲线的绘制:以光密度为纵坐标。
,葡萄糖的含量为横坐标,绘制标准曲线。按式(1)计算多糖得率。
Y=
C伊m
N伊V
伊100%。(1)
式(1)中:Y为多糖的得率,%;C为多糖的质量浓度,滋g/mL;N为稀释的倍数;V为酶解液体积,mL;1郾m4郾为蒲公英根粉质量3摇DPPH自由基清除率的测定
,g。
参照文献[12],将酶解液适当稀释,各处理组常温避光反应(2)DPPH计算清除率30min,525nm下测定吸光度,按式自由基清除率。
=(
1-AiA-0
Aj)伊100%。
式(2)中:A0为2mL无水乙醇+2mLDPPH溶液的(2)
吸光度;Ai为2mL待测液+2mLDPPH溶液的吸光度;A待测液+2mL无水乙醇的吸光度。
1郾5摇j为2mL数据统计方法
采用SPSS22郾0软件分析实验结果,差异显著水平为0郾05;使用Design鄄Expert8郾05软件分析响应面结果;使用Origin9郾0软件绘图。
2摇结果与分析
2郾1摇葡萄糖标准曲线分析
葡萄糖标准曲线回归方程为:
110食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2019年11月
2郾2摇单因素实验结果分析
线性良好(图1),可用于计算多糖含量。
y=0郾54583x+0郾04172,R2=0郾9940,该曲线
2郾2郾1摇料水比对酶解效果的影响
料水比对蒲公英根粉酶解效果的影响实验结果见图2。由图2可知:随着料水比的增加,木瓜蛋白酶和纤维素酶多糖得率均呈先上升后平缓趋势,木瓜蛋白酶的酶解效果优于纤维素酶;可溶性固形物含量和DPPH自由基清除率逐渐降低。当料水比较低时,底物分散程度差,不利于酶和底物充分接触,摇摇
Fig.1摇Standardcurveofglucose
图1摇葡萄糖标准曲线
料水比增加到一定程度后,酶促反应处于动态平衡,得率趋于平稳,而可溶性固形物被稀释,DPPH自由基的清除能力不断降低。由实验结果可知,适宜的2郾2郾2摇酶解温度对酶解效果的影响
酶解温度对蒲公英根酶解效果的影响见图3。由图3可知:随着酶解温度的升高,多糖得率、DPPH自由基清除率均呈先上升后下降的趋势;木瓜蛋白酶在50益时出现峰值,纤维素酶在60益时出现峰值;纤维素酶处理组的可溶性固形物含量随酶解温度升高而增加,木瓜蛋白酶处理组则呈先上升后下料水比为1颐30。
Fig.2摇Effectsofsolid鄄liquidratioonenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
图2摇料水比对蒲公英根多糖酶解效果的影响
降趋势。随着温度升高,酶活性增加,木瓜蛋白酶水解细胞壁上的糖蛋白,解除糖蛋白对多糖的束缚;纤维素酶作用于植物细胞壁上的纤维素,促进蒲公英根多糖的释放,进而多糖得率升高;当温度超过酶最适作用温度,酶解作用降低,导致多糖得率下降,DPPH自由基清除率与多糖含量相关,趋势同步。由实验结果可知,木瓜蛋白酶酶解的适宜温度为50益,纤
2郾2郾3摇酶添加量对酶解效果的影响
酶添加量对蒲公英根酶解效果的影响见图4。由图4可知:随着酶添加量的增加,多糖得率、DPPH
维素酶酶解的适宜温度为60益。
Fig.3摇Effectsoftemperatureonenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
图3摇酶解温度对蒲公英根多糖酶解效果的影响
第37卷第6期摇摇摇摇摇摇摇刘珊珊等:双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究111
摇
Fig.4摇Effectsofenzymeadditiononenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
图4摇酶添加量对蒲公英根多糖酶解效果的影响
自由基清除率和可溶性固形物含量均呈上升趋势。木瓜蛋白酶在添加量为0~2郾0mL,纤维素酶添加量为0~1郾0mL时,多糖得率明显升高,DPPH自由基清除率同步变化。继续增加酶量,多糖得率变化不大,这是因为随着酶添加量的增加,底物与酶接触机会增多,多糖能够更多地分离出来。当酶量达到一定量后,酶解反应趋于稳定,继续增加酶用量也很难明显提高多糖得率。由实验结果可知,木瓜蛋白酶的适宜添加量为2郾0mL,纤维素酶的适宜添加量为1郾0mL。
2郾2郾4摇双酶协同作用对酶解效果的影响2郾2郾4郾1摇酶添加量对双酶酶解效果的影响
加量过高时出现反馈抑制。由实验结果可知,木瓜2郾2郾4郾2摇酶解温度对双酶酶解效果的影响蛋白酶悬液的适宜添加量为2郾0mL。
酶解温度对蒲公英根双酶酶解效果的影响见
图6。由图6可知:随着酶解温度的增加,多糖得率、DPPH自由基清除率和可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势,且均在55益时出现峰值。故双2郾2郾4郾3摇酶解时间对双酶酶解效果的影响酶协同适宜的酶解温度为55益。
酶解时间对蒲公英根双酶酶解效果的影响见
图7。由图7可知:随着酶解时间的增加,多糖得率、2郾0h时出现峰值;可溶性固形物含量呈缓慢上升趋势。延长酶解时间有助于酶与底物充分结合,促进多糖溶出;但酶解时间过长可能会导致活性物质抗氧化能力减弱,生产周期变长、生产成本增加。由实验结果可知,适宜酶解时间为2郾0h。2郾3摇Box鄄Behnken响应面试验结果
Box鄄Behnken响应面试验结果见表2,方差分析DPPH自由基清除率均呈先上升后下降趋势,在
酶添加量对蒲公英根双酶酶解效果的影响见
1郾0mL时,随着木瓜蛋白酶悬液添加量的增加,多糖得率、DPPH自由基清除率和可溶性固形物含量均呈先上升后下降的趋势。木瓜蛋白酶添加量为2郾0mL时出现峰值,可能是因为在木瓜蛋白酶悬液添加量达到饱和之前,两者表现为增效作用,而当添
图5。由图5可知:在纤维素酶悬液添加量为
摇
Fig.5摇Effectsofenzymeadditiononsynergisticenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
图5摇酶添加量对蒲公英根多糖双酶协同酶解效果的影响
112食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2019年11月
摇
Fig.6摇Effectsofhydrolysistemperatureonsynergisticenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
图6摇酶解温度对蒲公英根多糖双酶协同酶解效果的影响
摇
Fig.7摇Effectsofhydrolysistimeonsynergisticenzymatichydrolysisofdandelionrootpolysaccharide
Tab.2摇ExperimentalresultsofBox鄄Behnkenexperiment
试验序号
1234567810111213141516179
A1-100001010-10100
B0-101-101-100-1000110
C100-10100100-1-1-1100
多糖得率/%
22郾1032郾2326郾1433郾0329郾6624郾0030郾2933郾3423郾5028郾4024郾2632郾7633郾1625郾1229郾6725郾7925郾15
图7摇酶解时间对蒲公英根多糖双酶协同酶解效果的影响
结果如表3。多糖得率为22郾10%~33郾34%,蒲公英根多糖得率(Y1)对酶解温度(A)、酶解时间(B)和酶添加量(C)的二次多项回归方程,见式(3)。Y1=32郾9-0郾59A-0郾60B-0郾54C+0郾34AB-0郾93AC-0郾47BC-6郾7A2-1郾73B2-1郾67C2。
(3)
表2摇Box鄄Behnken试验设计与结果
方差分析结果表明,建立的模型具有很高的显著性(P<0郾0001,F=92郾54),模型的失拟项P值为0郾2237,大于0郾05,失拟项检验不显著,说明模型适当。可以看出,影响多糖得率的因素按照由大到小顺序依次为:酶解时间(B)、酶解温度(A)、酶添B2、C2、AC对Y的影响显著(P<0郾05),因此,交互项和二次项对响应值也有较大的影响。
加量(C)。在所选各因素水平范围内,A、B、C、A2、
-1
响应面模型可靠性分析见表4,试验模型拟合度为0郾9917,表示试验结果的预测值与实际值高度相25郾360,变异系数为1郾900,说明试验结果较可靠,建立的模型能够较好地描述多糖得率随酶解条件的变化规律,可用此模型对多糖得率进行分析和预测。关;校正决定系数为0郾9809,模型的精密度为
-1
第37卷第6期摇摇摇摇摇摇摇刘珊珊等:双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究
Tab.3摇Varianceanalysisofregressionmodel
方差来源模型A(酶解温度)B(酶解时间)C(酶添加量)ABACBCA2B2C2残差失拟项纯误差总离差
平方和自由度均方差239郾342郾832郾882郾310郾483郾460郾88188郾8412郾6311郾72郾011郾270郾75241郾35
911111111173416
26郾592郾832郾882郾310郾483郾460郾88
F值92郾549郾8610郾028郾041郾6612郾043郾07
P值
<0郾0001显著0郾01640郾01580郾02520郾2390郾01040郾123
113
表3摇回归模型方差分析
Tab.4摇Reliabilityanalysisofresponsesurfacemodel
摇摇参数拟合度
0郾99170郾98090郾911325郾3601郾900主模型
表4摇响应面模型可靠性分析
校正决定系数预测拟合度模型的精密度变异系数
任何两个交互因素的响应面都存在最高点,酶解时间和酶解温度对多糖得率的影响较大,酶添加量对得率的影响较小。通过软件Design鄄Expert8郾05分析,适宜酶解条件:酶解温度为55郾31益,酶解时间为1郾9h,纤维素酶液添加量0郾99mL,木瓜蛋白酶液添加量1郾98mL,料水比1颐30,在此条件下多糖得率32郾97mg/g,与预测值的相对误差为0郾08mg/g,说明该响应面结果可靠。
蒲公英根粉处理前后多糖含量和DPPH自由基清除率情况如表5。由表5可知,蒲公英根经过烘焙后多糖含量升高至(18郾74依0郾58)mg/g,这可能是因为烘焙使原料水分降低、孔结构也发生了变化,的预测值为32郾89mg/g,验证实验多糖得率为
188郾84657郾14<0郾000112郾6311郾70郾290郾420郾19
2郾26
0郾2237不显著
43郾9540郾72
0郾00030郾0004
摇摇由回归方程所做的响应面图如图8。由回归方程可知,二次项系数为负值,表明方程具有最大值。
Fig.8摇Responsesurfacediagramofinteractionofvariousfactors
图8摇各因素交互作用的响应面图
114食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2019年11月
有利于物质的提取[13]。有报道显示,高温会导致纤维素和半纤维素糖苷键断裂,生成大量脱水糖、酮类以及聚合度不同的糖类活性中间体[14],其详细的裂解机理仍有待进一步研究。采用双酶协同酶解后多达92郾31%依0郾25%,酶解液抗氧化性显著提高。
表5摇酶解前后蒲公英多糖得率及DPPH自由基清除率Tab.5摇PolysaccharideyieldandDPPHfreeradicalscavenging
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exertanticancereffectonHepatocellularcarcinomabyinhibitingPI3K/AKT/mTORpathwayandenhancingenzymatichydrolysis
样品
多糖得率/%DPPH自由基清除率/%
烘焙前蒲公英根原料10郾18依0郾1828郾73依1郾01蒲公英根烘焙粉摇摇18郾74依0郾5855郾69依0郾41蒲公英根粉酶解液摇
32郾97依0郾13
92郾31依0郾25
3摇结摇论
为:料水比1)采用单酶法提取蒲公英根多糖的适宜条件
益,添加量(g颐1郾0mL)1颐mL;木瓜蛋白酶酶解温度30g/mL,纤维素酶酶解温度60益,添加
50量为2郾0mL。
多糖提取率高于单酶法2)纤维素酶和木瓜蛋白酶协同提取蒲公英根
。采用Box鄄Behnken响应面试验建立了双酶协同提取蒲公英根多糖的二次多项式回归模型,影响多糖得率的工艺因素主次顺序为酶解时间、酶解温度、酶添加量。确定了适宜的酶解条件为:酶解温度55益,酶解时间1郾9h,纤维素酶液添加量0郾99mL(200U/mL),木瓜蛋白酶液添加量1郾98mL(200U/mL),料水比(g颐mL)1颐30。DPPH烘焙和酶解工艺可提高蒲公英根多糖得率和
自由基清除率,二者存在正相关关系。
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OptimizationofSynergisticEnzymaticHydrolysisofPolysaccharideExtractionfromDandelionRootand
StudyonItsAntioxidantActivity
(CollegeofFoodScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China)Abstract:Takingthebakingpowderofdandelionrootasrawmaterial,theeffectsoftheamoutofaddition,enzymatichydrolysistime,andenzymatichydrolysistemperatureofthesingleorsynergisticenzymatichydrolysistechnologyonpolysaccharidesyieldsandtheeffectsonthefreeradicalscavenging1gdandelionrootsbysingleenzymaticmethodwereasfollows:ratioofwatertorawmaterial(g颐mL)1郾0mL,temperatureofpapainenzymatichydrolysiswas60益,andtheamountofadditionwas2郾0mL.
LIUShanshan,摇LIUYaqiong*,摇ZHANGQi,摇LUYao
rateofDPPHwerestudied,andresponsesurfacemethodologywasusedtooptimizetheeffectsof
processingparameters.Theresultsshowedthattheoptimumconditionsforextractingpolysaccharidesfromwas1颐30,temperatureofcellulaseenzymatichydrolysiswas50益,andtheamountofadditionwasTheresultsalsoshowedthatthesynergisticenzymatichydrolysiswassuperiortothesingleenzymemethodprimarytosecondary,weretime,temperatureandtheamountofaddition.Theoptimalextractionintheextractionofpolysaccharide.Theaffectingfactorsofenzymatichydrolysistechnologyorder,from
1颐30,additionofpapainenzyme(200U/mL)was1郾98mLandcellulaseenzyme(200U/mL)was0郾99mL,extractiontemperaturewas55益,extractiontimewas1郾9h.Undertheseconditions,thewas92郾31%依0郾25%.Sotheyieldofpolysaccharidesfromdandelionrootandfreeradicalscavengingratewereimprovedbybakingandenzymatichydrolysis.
freeradical
experimentalyieldofpolysaccharideswas32郾97%依0郾13%,thefreeradicalscavengingrateofDPPH
conditionsofpolysaccharidesweredeterminedasfollows:ratioofwatertorawmaterial(g颐mL)was
Keywords:dandelionroot;polysaccharide;cellulase;papain;synergisticenzymatichydrolysis;DPPH
(责任编辑:叶红波)
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