大肠杆菌质粒DNA的提取

实验目的

学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的方法

实验原理

大肠杆菌质粒DNA的提取是从事基因工程工作的一项基本实验技术，碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法之一，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离的目的；具体为：溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+ 和Mg2+ 螯和，抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性，通过离心吸附柱分离，进行电泳鉴定。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。

实验材料、仪器和试剂

材料：大肠杆菌DH5α

仪器：1.5ml塑料离心管，微量移液枪，台式高速离心机，恒温摇床 试剂：质粒DNA提取试剂盒

实验步骤和各步骤相应的注意事项

一、 培养细菌使质粒扩增

将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃过夜培养。注意：培养时间不宜过长，一般12~16小时为宜，否则影响细菌质粒的得率。 二、 收集和裂解细菌

1. 取 1.5ml 细菌培养物于EP管中，4000rpm 离心2分钟，弃上清液，收集菌体，使细菌沉淀尽量干燥；注意：上清为培养基，必须倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多的培养基残留可能会影响后续实验。

2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的250μl溶液 I (50 mmol/L)葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 中，剧烈振荡；注意：为了保证菌体悬浮均匀，必须充分混匀至看不见沉淀物质，可以用移液枪吹打或者混匀器震荡。

3. 加入250μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）) ，盖紧EP管口，柔和颠倒离心管（2分钟左右），以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，使溶液变为澄清为止；注意：NaOH溶液最好是新鲜配制，足够的碱性保证其溶解细胞膜的效率；不可剧烈震荡，时间不要过长，否者基因组DNA会断裂。 三、分离和纯化质粒DNA

1. 加入350μl预冷溶液III(每100 ml的溶液III中含60 ml乙酸钾(5 mol/L)，11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复轻柔颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀；注意：不可剧烈震荡，此时出现白色沉淀。

2. 室温下12000rpm离心10min，取上清液放入离心柱中，12000rpm离心1min，将收集管中的废液倒掉（收集管继续使用）；500μl Buffer HB洗1次，

700μl DNA wash buffer洗2次。每次均为12000rpm离心1min。

3. 把柱子拿出来换个收集管，加入30μl的EB（10mM Tris-HCL,pH 8.5）放置2分钟,离心之后取样5μl加到Loading buffer中混匀。

4. 电泳鉴定。 结果

讨论

溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全，SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀，因为基因组DNA太长，容易被PDS给共沉淀，尽管SDS并不与DNA分子结合；醋酸为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，并不是理想中的超螺旋、线性和开环这三条带，碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）如果不小心在溶液II加入后过度振荡或者碱处理时间过长，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，然而不管变性或者是复性，DNA分子都溶于中性溶液。

所有的实验用品均需高温处理，以灭活残余的DNA酶，所有试剂均需要用高压灭菌双蒸水配制。