水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆及应用的制作方法

技术要求

1.一种水稻耐盐胁迫基因OsMYB106，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.一种植物表达载体，它插入了权利要求1所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106。3.如权利要求1所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106在提高水稻盐胁迫耐受能力方面的应

用。

技术说明书

水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆及应用技术领域

本技术属于植物分子生物学与植物基因工程技术领域，具体涉及水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆及应用。背景技术

土壤盐碱化是一个世界性的资源问题和生态问题。全世界有约9.45亿多公顷的土地受盐胁迫的影响，大约占了全球陆地面积的6%，全世界灌溉农业面积的20%。中国是盐碱地大国，现有内陆盐碱地面积近1亿公顷，滩涂面积234万公顷，盐碱地面积位居世界第三，主要分布在西北、东北、华北及滨海地区。中国东北地区盐碱土的主要形式是苏打盐碱地，面积高达756万公顷。其中，吉林省西部12个市县盐碱土面积为160多万公顷。面对人口数目不断增长，可使用的耕地面积有限，土地的不合理灌溉和利用引发了土壤次生盐渍化现象日益严重和水稻产量很难显著提高等实际生产问题，开发利用好沿海滩涂以及内陆的盐碱地资源是保障耕地面积的有效途径之一。水稻是中度盐敏感作物，生长在水环境中，种植水稻可以对土壤的可溶性盐碱起到淋溶的作用。因此，水稻是开发沿海滩涂和盐碱地的首选粮食作物。

通过遗传改良提高水稻耐盐能力是提高水稻种植面积和产量的有效途径之一。目前在育种上利用的耐盐QTL主要是位于水稻第1号染色体上的qSKC-1和Saltol两个位点。随着分子生物技术的发展，利用突变体来分离和挖掘水稻的耐盐胁迫基因，并且用于水稻基因工程进行辅助育种和耐盐胁迫改良对有效控制盐胁迫对水稻的危害、提高水稻产量和改良水稻品质具有极其重要的意义。MYB转录因子是在真核生物中广泛存在的一类转录因子。所有的MYB 家族成员都含有保守的DNA 结合结构域—MYB结构域。根据其含有

MYB结构域数目的不同分为四类：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB，其

中，R2R3-MYB 具有两个MYB 结构域，是含有基因数量最多的一个亚家族。在植物中，MYB 转录因子参与生长发育、次级代谢、植物激素信号转导、生物与非生物胁迫应答等各种生物学过程。前期研究表明MYB 转录因子分别在转录水平、转录后水平和蛋白水平参与干旱胁迫、盐胁迫、高/低温胁迫、重金属胁迫等多种非生物胁迫应答，但还未见利用基因OsMYB106提高植物抗盐性的报道。技术内容

本技术目的是为解决土壤次生盐渍化现象日益严重、水稻产量很难显著提高的问题，而提供一种水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆及应用。

一种水稻耐盐胁迫基因OsMYB106，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。一种植物表达载体，它插入了所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106。

所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106在提高水稻盐胁迫耐受能力方面的应用。

本技术提供了一种水稻耐盐胁迫基因OsMYB106，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；一种植物表达载体，它插入了所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106；所述的水稻耐盐胁迫基因OsMYB106在提高水稻盐胁迫耐受能力方面的应用。本技术通过农杆菌介导的转化方法，将OsMYB106过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株；发现在盐胁迫条件下，OsMYB106过表达植株OsMYB106OX-1、OsMYB106OX-

2和OsMYB106OX-3的存活率显著高于野生型日本晴的存活率，说明水稻中的基

因OsMYB106能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。附图说明

图1 遗传转化载体pCsV1300的结构示意图；

图2 转基因水稻植株与野生型日本晴中水稻耐盐胁迫相关基因OsMYB106表达量检测结果示意图；

图3 转基因水稻植株与野生型日本晴盐胁迫处理后的表型示意图；图4 转基因水稻植株与野生型日本晴盐胁迫处理后的存活率统计示意图。具体实施方式

实施例1 水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆

在CRISPR/Cas9水稻突变体库（Oryza sativa L. var Nipponbare背景）筛选对盐胁迫敏感的突变体过程中，发现了一个对盐胁迫敏感的突变体L19，其存活率显著低于野生型日本晴。通过DNA测序，发现该材料中在OsMYB106（LOC_Os08g33660）基因起始密码子下游第55位有一个碱基A的插入，导致第88位产生终止密码子，因此，认

为L19是OsMYB106的缺失性突变体，由于OsMYB106的突变导致L19对盐胁迫耐受性下降，说明OsMYB106在水稻盐胁迫应答过程中起到积极的作用。在数据库Phytozome

12（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中，查找到OsMYB106基因全长cDNA序

列。OsMYB106基因开放阅读框（ORF）核苷酸序列长度为1074 bp，编码一种由357个氨基酸组成的蛋白质。

1、RNA的提取

利用TRIzol Reagent（Invitrogen, USA）提取水稻叶片的总RNA；

1）将水稻品种日本晴（Oryza sativa L. var. Nipponbare）于人工气候室（200 μMphotonsm-2s-1光强；14 h/10 h光周期；25℃温度；60%相对湿度）培养至三叶一心期，取水稻叶

片，放入装有2粒磁珠的2 ml管中，置于液氮中；

2）使用组织破碎仪进行磨样，磨样所需的适配器需放入液氮中提前进行预冷，将装有样

品的管子装入适配器中，上机，频率为1400 rpm/s，磨样时间一般为90 s，将样品磨至粉末；

3）向样品管中加入1 ml TRIzol Reagent提取液，使用涡旋仪将样品和提取液迅速混匀；4）将裂解液放置15-25℃条件下10 min，以保证样品被充分裂解，同时用磁铁将磁珠吸

出；

5）移至台式高速离心机，12,000 ×g 4℃离心10 min；

6）吸取上清液至新的1.5 ml管中，每个样品中加入0.2 ml的氯仿。盖紧盖子，使用涡旋仪

充分震荡每个样品30 s，15-25℃静置2-15 min；

7）在2-8℃条件下，12,000 ×g离心15 min；

8）离心后会产生3个分层，将最上层无色液体转移到新的离心管中；

9）每个样品中加入500 ml的异丙醇，上下颠倒，充分混匀。在15-25℃放置5-10 min，使RNA充分沉淀；

10）在2-8℃条件下，12,000×g离心10 min，去除上清；

11）加入1 ml用DEPC水配制的75%乙醇，上下颠倒充分漂洗RNA沉淀；12）在2-8℃条件下，7500×g离心5 min，去除上清；

13）在2-8℃条件下，7500×g离心短暂离心，用枪将多余的乙醇吸走，在空气中干燥5-10min（不能太干，否则不易溶解）；

14）加入30 μl DEPC处理水，将RNA充分溶解；

15）用NanoDrop 2000测定各样品浓度，A260/A280值在2.0-2.2为合格。取2 μl RNA进行

琼脂糖凝胶电泳进行检测。样品保存于-80℃超低温冰箱，待用。

2、cDNA的合成

取2 μg RNA进行反转录，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis

SuperMix反转录试剂盒（TransGen Biotech, China），将RNA反转录为cDNA。cDNA合成反应体系如下表1：

将上述液体轻轻混匀，简单离心。反应条件为42℃ 30 min，85℃ 5 s终止反应，用

NanoDrop 2000测定cDNA浓度。3、OsMYB106基因cDNA全长的获得

根据OsMYB106在数据库中的cDNA序列，利用Primer 5.0软件，设计可以扩增全长ORF的一对特异性引物（OsMYB106-F/OsMYB106-R），为了方便下一步载体的构建，在引物

5’端添加限制性内切酶酶切位点，得到用于下一步PCR扩增水稻耐盐胁迫基

因OsMYB106所用的一对引物（OsMYB106-Xba-F/OsMYB106-EcoR-R）。以反转录的

cDNA为模板，成功获得预期大小的cDNA全长。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃

变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1min，32个循环；72℃后延伸10 min。

OsMYB106-Xba-F：5’-gctctagaATGGGGCGTTCACCATGC-3’OsMYB106-EcoR-R：5’-cggaattcCTAGAGCAAAGGTGGCTGCA-3’

反应结束后，进行电泳，产物回收，将回收的片段连入载体pMD18-T，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，获得有完整阅读框、无错配、无移码的cDNA全长，其核苷酸序列如SEQID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2 水稻耐盐胁迫基因OsMYB106超量表达载体的构建

1）用Xba和EcoR双酶切双元载体pCsV1300，跑胶回收大片段（载体）；

2）用Xba和EcoR双酶切实施例1中得到的包含有水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的T载

体，消化后跑胶回收包含有水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的DNA片段（基因）；

3）把回收的载体与基因进行连接。

4）转化大肠杆菌感受态、挑取单克隆进行PCR检测。

5）对于检测为阳性的单克隆过夜培养，提取质粒进行酶切验证。

实施例3 农杆菌介导的水稻遗传转化体系与鉴定

1）选取成熟饱满的水稻品种日本晴种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭

菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞（含有0.1%的吐温20）浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基，32℃光照培养5~10 d；

2）将实施例2得到的含有水稻耐盐胁迫基因OsMYB106表达载体转化到农杆菌中。在侵染

的前2 d，取农杆菌在含50 mg/l kanamycin的LB培养基上划线，置于28℃培养；

3）侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基中，28℃，180 rpm震荡培养3~3.5 h，然后用

悬浮培养基调节菌液浓度至OD600=0.1~0.2。将诱导5~10 d的愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5~10 min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹30 min，直到吹干。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基，先20℃暗培养过夜，然后转入25℃培养箱继续暗培养2 d；

4）共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器中。用灭菌蒸馏水反复清洗愈

伤7~8次，其中前面3次可快速清洗，后面3~4次清洗时每次浸泡3~5 min。最后用含有

500mg/l 羧苄青霉素（Carbenicillin，Cn）的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30 min。倒掉Cn溶液，用

灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹1 h；

5）将经过清菌后的愈伤摆放到含有潮霉素的筛选培养基上32℃，光照培养14 d；6）筛选14 d后，将抗性愈伤转入分化培养基，28℃培养 (光周期为14 h光照/10 h黑暗)；7）待抗性愈伤在分化培养基上形成3~4 cm高的再生苗时，将其转入生根培养基培养，至

形成完整的转基因水稻植株。转基因水稻的自交后代，可以采用潮霉素进行纯合转基因植株的筛选。

实施例4 T2代纯合转基因水稻中OsMYB106表达水平检测

取生长至三叶一心期的野生型日本晴和转基因水稻植株的叶片，提取RNA用于基因相对表达量的分析。利用Real-time PCR仪（ABI, USA）进行RT-qPCR。RNA提取与cDNA的合成同实施例1；之后将cDNA稀释10倍，按照试剂盒THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix

Without Rox（TOYOBO, Japan）说明进行RT-qPCR；通过Primer Express 3.0设计RT-qPCR

所用的引物，以OsGAPDH为内参基因，所用引物如下：

qRT-OsMYB106-F：5’-CACCCACAAAGCCATCAACG-3’qRT-OsMYB106-R：5’-GCTGAGACTGGCTGTGACTT-3’OsGAPDH-F：5’-CTGAGAATAAAACGTGGACGGTG-3’OsGAPDH-R：5’-TCCATATCATCAGCATCGTTACAAC-3’

RT-qPCR的结果显示，与野生型相比，3个独立的OsMYB106过表达植株（OsMYB106OX-1、OsMYB106OX-2和OsMYB106OX-3）中OsMYB106的表达水平增加约15倍以上（如图2所示）。

实施例5 OsMYB106过表达植株的耐盐性测试

将生长至三叶一心期的野生型日本晴和纯合的OsMYB106过表达转基因植株

（OsMYB106OX-1、OsMYB106OX-2和OsMYB106OX-3）移至含有100 mM NaCl的营养液中，处理5d后观察表型及统计存活率，发现与野生型日本晴相比，OsMYB106过表达植株对盐胁迫的耐受性增强，其存活率显著的高于野生型日本晴（如图3~4）。

根据上述实施例，本技术通过前期对利用CRISPR/Cas9技术制备的水稻突变体库进行盐胁迫筛选过程中，得到一个在盐胁迫应答过程中扮演重要角色的基因OsMYB106；我们通过农杆菌介导的转化方法，将OsMYB106过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株；我们发现在盐胁迫条件下，OsMYB106过表达植株OsMYB106OX-

1、OsMYB106OX-2和OsMYB106OX-3的存活率显著高于野生型日本晴的存活率；上述结

果说明水稻中的基因OsMYB106能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。序列表

<110> 东北师范大学

<120> 水稻耐盐胁迫基因OsMYB106的克隆及应用<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 1074<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L. var. Nipponbare)<400> 1

atggggcgtt caccatgctg tgagaagatt ggcctgaaga aaggtccatg gacaccagag 60gaagaccaga agctgcttgc atacattgag gagcatggac atggcagctg gcgagcattg 120ccttcaaaag ccggtttgca gaggtgcggc aagagttgca ggttgcgatg gacaaactac 180

ctgagaccag acatcaagag aggaaaattc agcttacaag aagagcagac catcatccaa 240cttcatgctc ttcttggaaa caggtggtct gccattgcaa cacatctacc aaagcgcact 300gacaatgaga tcaagaacta ttggaacacc cacctgaaaa agaggttggc caagatggga 360attgatcctg tcacccacaa agccatcaac ggcactctga acaacacggc gggagacaaa 420tcagccaaag tcacagccag tctcagccac atggctcagt gggagagtgc ccgcctcgag 480gccgaggcac ggcttgctcg agaatccaag atgcgcatag cagcttctac accaagcaaa 540ctccatgcac agtcaaccaa cccacctgct tcaacacctt ctccatgctt cgatgtgttg 600aatgcatggc agagtgcaaa gatagacctg gagtcaccca cctccacact gacgttcgca 660gggagtaatg ctagcatgct gccattctca acaacaaccg ccctagaatt atccgaaagc 720aactccaatg tgtggcagca aagaagcgat gaactggagg gtgaagaaag tgagtggaag 780tttgtcagta agcaacaact gcagggaatg catggtaaag agacagaaga acacttcatt 840ggctgtgagg agtcatggtt cccagggaca gccaatatcg gagcaggctt cacaggcatg 900ctgcttgatg gatccaatat gcatgataca tcagaatgct gggatgagtc cagcaatggc 960caagatgagc aaagaagcca ggtgtcagaa gatgcagaga ataagaacta ttggaatggc 1020atcttcagta tggtgaattc agagcagcca cccctgcagc cacctttgct ctag 1074<210> 2<211> 357<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L. var. Nipponbare)<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Ile Gly Leu Lys Lys Gly Pro1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Leu Leu Ala Tyr Ile Glu Glu His20 25 30

Gly His Gly Ser Trp Arg Ala Leu Pro Ser Lys Ala Gly Leu Gln Arg35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp50 55 60

Ile Lys Arg Gly Lys Phe Ser Leu Gln Glu Glu Gln Thr Ile Ile Gln65 70 75 80

Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Thr His Leu85 90 95

Pro Lys Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu100 105 110

Lys Lys Arg Leu Ala Lys Met Gly Ile Asp Pro Val Thr His Lys Ala115 120 125

Ile Asn Gly Thr Leu Asn Asn Thr Ala Gly Asp Lys Ser Ala Lys Val130 135 140

Thr Ala Ser Leu Ser His Met Ala Gln Trp Glu Ser Ala Arg Leu Glu145 150 155 160

Ala Glu Ala Arg Leu Ala Arg Glu Ser Lys Met Arg Ile Ala Ala Ser165 170 175

Thr Pro Ser Lys Leu His Ala Gln Ser Thr Asn Pro Pro Ala Ser Thr180 185 190

Pro Ser Pro Cys Phe Asp Val Leu Asn Ala Trp Gln Ser Ala Lys Ile195 200 205

Asp Leu Glu Ser Pro Thr Ser Thr Leu Thr Phe Ala Gly Ser Asn Ala210 215 220

Ser Met Leu Pro Phe Ser Thr Thr Thr Ala Leu Glu Leu Ser Glu Ser225 230 235 240

Asn Ser Asn Val Trp Gln Gln Arg Ser Asp Glu Leu Glu Gly Glu Glu245 250 255

Ser Glu Trp Lys Phe Val Ser Lys Gln Gln Leu Gln Gly Met His Gly260 265 270

Lys Glu Thr Glu Glu His Phe Ile Gly Cys Glu Glu Ser Trp Phe Pro275 280 285

Gly Thr Ala Asn Ile Gly Ala Gly Phe Thr Gly Met Leu Leu Asp Gly290 295 300

Ser Asn Met His Asp Thr Ser Glu Cys Trp Asp Glu Ser Ser Asn Gly305 310 315 320

Gln Asp Glu Gln Arg Ser Gln Val Ser Glu Asp Ala Glu Asn Lys Asn325 330 335

Tyr Trp Asn Gly Ile Phe Ser Met Val Asn Ser Glu Gln Pro Pro Leu340 345 350Gln Pro Pro Leu Leu355