杨海朋;王自强;王云山;张利平;苏志国
【摘 要】产酸丙酸杆菌在发酵生产丙酸的同时也会伴随有机杂酸的产生,通过对4种有机酸的监测以期调控发酵条件,从而使丙酸高产.应用HPLC的方法分别研究了在不同流动相种类、pH、洗脱条件、流速、柱温条件下四种有机酸的分离状况,建立了快速、简便测定丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸四种有机酸的方法.结果表明,色谱柱条件为COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm),检测器为紫外检测器,紫外检测波长为210nm,流动相为K2HPO4缓冲液(0.02 mol/L)和乙腈(0～1％梯度洗脱),流速1.0 mL/min,柱温25℃,进样量10 μL,采用外标法定量.在该条件下各物质线性回归方程相关系数均＞0.999,加样回收率均在95％～105％,精密度实验结果相对标准偏差均＜5.0％,表明该方法准确度高、精密度好,可为丙酸发酵过程中四种有机酸的监控及发酵调控提供数据参考. 【期刊名称】《中国酿造》 【年(卷),期】2016(035)005 【总页数】4页(P107-110)
【关键词】高效液相色谱;丙酸;发酵;有机酸;检测 【作 者】杨海朋;王自强;王云山;张利平;苏志国
【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,
北京100190;河北大学生命科学学院,河北保定071002;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190 【正文语种】中 文 【中图分类】Q815
丙酸又称甲基乙酸，是一种常见的天然有机弱酸，无色透明带刺激气味的液体，有吸湿性，具有爆炸危险［1］。对人畜基本无害，被广泛应用于谷物、饲料和食品的防腐保鲜中［2-3］。同时也可用于制取有机化工原料及中间体α-氯丙酸、2，2-二氯丙酸和α-嗅丙酸等［4］。在医药领域，丙酸可作医药中间体［5］。其生产方法主要有两种：一是化学合成法，主要以石油为原料经过丙醛氧化或乙烯羟基化生产［6］；二是微生物发酵法，用丙酸杆菌代谢得到丙酸。
在目前广泛使用的三大防腐剂中，丙酸是公认的最经济实惠且安全有效的食用性防腐剂，微生物发酵法生产丙酸作为绿色安全的生产方法得到了广泛的关注，但产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）在发酵生产丙酸时，同时会产生一定乙酸、乳酸、丁二酸等有机杂酸，不仅降低了糖酸转化率，同时为后期的分离提纯产生了很大的影响。发酵过程中对这4种有机酸含量的监测以期调控发酵条件，实现丙酸产量的提高是需要解决的首要问题。
目前丙酸的检测中一般采用水蒸气蒸馏提取法，反向液相色谱［7］和气相色谱法［8-9］，而乳酸、乙酸和丁二酸有报道通过中和滴定法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［10］、生物传感器法、直接进样色谱法、酯化处理间接进样色谱法、比色法和综合测定等方法进行测定［11］，其中HPLC法具有样品预处理简单、灵敏度高和分析时间短等优点［12］。本研究通过应用HPLC的方法对4种有机酸的分离条件进行研究，使4种有机酸通过HPLC方法很好的分离，方便发酵过程中4种有机酸的监控，为丙
酸的发酵调控提供一定的数据参考。 1.1 材料与试剂
产酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）WY 320菌株：本实验室筛选保藏。
酵母浸膏：安琪酵母股份有限公司；玉米浆干粉：河北灵山鹤植物蛋白制造有限公司；葡萄糖、氨水、硫酸铵、丙酸钠、丁二酸钠、乙酸钠、乳酸钙（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：Fisher公司；磷酸氢二钾（色谱纯）：西陇化工股份有限公司。
种子培养基：葡萄糖35 g/L，玉米浆20 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，pH控制7.0；
发酵培养基：葡萄糖60 g/L，玉米浆30 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸氢二钾4 g/L，pH控制在7.0。 1.2 仪器与设备
LC-20AT高效液相色谱仪（配置LCsolution色谱工作站，LC-20AT恒流泵，SIL-20A进样器，SPD-20A紫外检测器）：日本岛津公司；COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm× 250 mm）：北京吉瑞森科技有限责任公司；7L全自动搅拌式发酵罐：上海百仑生物科技有限公司，PL 203电子天平、Delta 320 pH计：瑞士梅特勒托利多公司；SHB-111循环水式多用真空泵：上海振捷实验设备有限公司。 1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
分别精确称取4种有机酸1 g，用超纯水分别定容至100 m L，配制成质量浓度为10 g/L的母液，备用。 1.3.2 样品制备
将活化后由甘油管保存的2 m L产酸丙酸杆菌菌液接种到50 m L种子培养基，
30℃培养48 h；后转接至500 m L种子培养基，30℃培养48 h；按10%的接种量接种到7 L发酵罐中，30℃、50 r/min发酵50 h，10 000 r/min离心5 min，取上清放入4℃冰箱冷藏，备用。 1.3.3 检测波长的确定
本实验采用色谱柱COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm× 250 mm），紫外检测器，在检测温度40℃，进样量10 μL等条件下研究样品的最佳分离条件。
因丙酸、乙酸、乳酸和丁二酸在波长210 nm处均有较为明显的吸收［13-14］，故检测波长选择210 nm。 1.3.4 流动相种类的确定
通过查阅柱子及待分离物质的性质来确定流动相种类。 1.3.5 色谱条件的确定
分别在pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0时，流动相的乙腈浓度在0～1%、1%～2%、0～2%，柱温分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，流速分别在0.4m L/min、0.6m L/min、 0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4m L/min、1.6 m L/min时进行4种有机酸分离情况的研究。 1.3.6 标准曲线的绘制
分别配制标准溶液质量浓度为1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L，按照已确定的最优条件方法，应用HPLC的同时联用紫外检测器，使4种经过C18柱子分离的物质分别经过紫外检测器进行标准曲线的绘制。 1.3.7 重复性实验
取发酵50 h离心后的上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，0.22 μm滤膜过滤，分别配制6次相同上清液进行测定，采用优化后的HPLC条件进行重复性实验。 1.3.8 精密度实验
取发酵50 h离心后的上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，0.22 μm滤膜过滤，采用优化后的HPLC条件，对一个样品重复进样6次进行精密度实验。 1.3.9 加样回收率实验
取已知含量的样品，准确加入定量的标准品。重复进样6次，采用已优化好的HPLC条件测定各物质总含量，并计算其加样回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。 2.1 流动相种类的确定
通过查阅柱子及分离物质的性质，确定流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）和乙腈［15］。一方面COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱采用高纯度耐酸碱的硅胶为填料，在全水情况下分离情况良好；另一方面发酵液中4种有机酸性质较为相近，均为亲水性较强的有机酸且许多缓冲溶液在波长210 nm附近有较强的吸收，使得本底值提高，灵敏度降低，有时根本无法测定。磷酸盐缓冲溶液是最典型、适用的洗脱液，在紫外区几乎无吸收，可作为有机酸测定的流动相，故选择K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）作为流动相，乙腈为有机溶剂帮助洗脱；再有考虑到流动相pH对酸的电离和柱子寿命的影响，采用稀H3PO4作为流动相pH的调节酸。
2.2 流动相pH的确定
在pH3.0，4%乙腈，流速1.0 m L/min，室温（25℃）条件下考察流动相不同pH值时4种有机酸的分离情况。丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的酸度系数（pKa）分别为4.874、3.860、4.757、4.218，因C18柱子分离原理是分子的疏水性，而4种酸在pH≤4.0时以分子状态存在，另一方面pH过低会影响柱子使用寿命，故分别取pH在2.0，2.5，3.0，3.5，4.0（用4%稀H3PO4进行pH的调节）时进行研究，结果见图1。
由图1可知，pH在2.0、2.5、3.0、3.5时乳酸和乙酸分离效果不好，丁二酸和丙
酸出峰时间过晚，pH在4.0时4种酸分离效果较好且出峰时间相对较早，保留时间相差较大，故选择最优pH值为4.0。 2.3 乙腈洗脱浓度的确定
在pH4.0，流速1.0 m L/min，室温（25℃）条件下考察不同乙腈洗脱浓度时4种有机酸的分离情况。选择流动相的乙腈洗脱浓度在0～1%，1%～2%，0～2%进行乙腈梯度洗脱的研究，结果见图2。
由图2可知，乙腈浓度在0～1%梯度洗脱时，效果最好，故最优乙腈洗脱浓度为0～1%梯度洗脱。 2.4 柱温的确定
在pH 4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/min条件下考察不同柱温时4种有机酸的分离情况。选择温度分别在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃时进行四种有机酸分离情况的研究，结果见图3。
由图3可知，柱温对于4种物质的分离情况影响不大，分离差异不明显，在25℃时分离效果较好，故最优柱温为25℃。2.5流速的确定
在pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），室温（25℃）条件下考察不同流速时4种有机酸的分离情况。分别选取流速为0.4m L/min、0.6m L/min、0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4 m L/min、1.6 m L/min进行4种酸分离情况的研究，结果见图4。
由图4可知，随着流速的不断增加，洗脱时间逐渐变短，分离效果逐渐变差。且可以看出在0.4 m L/m in时分离效果最佳，但此条件下整个检测方法耗时过长，考虑到检测方法耗时和分离情况的综合因素，最优流速选为1.0 m L/min。 2.6 标准曲线
按照最优色谱条件即流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L），pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/m in，室温（25℃）时进行标准曲线的测定，
应用HPLC的同时联用紫外检测器，使4种经过C18柱子分离的物质分别经过紫外检测器进行测定，其高效液相色谱图见图5，4种物质的线性回归方程及相关指标见表1。
由图5和表1可知，各种物质有很好的分离效果，以组分浓度X对峰面积Y进行线性拟合，方程的相关系数均＞0.999。 2.7 重复性实验
取发酵50 h离心后的发酵上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，用0.22 μm的滤膜过滤，分别配制6次相同上清液进行测定，采用优化后的HPLC条件进行准确度实验，分离情况见图6。
分别计算4种物质的相对标准偏差（RSD），结果为丙酸2.87%，乙酸2.73%，乳酸2.03%，丁二酸2.42%，4种物质的RSD均＜5%，可见此分析方法重复性良好，可满足分析要求。 2.8 精密度实验
取发酵50 h离心后的发酵上清液，4%稀H3PO4稀释50倍，用0.22 μm的滤膜过滤，采用优化后的HPLC条件进行精密度实验，对一个样品重复进样6次，计算4种物质检测结果的相对标准偏差分别为丙酸2.47%，乙酸1.68%，乳酸2.38%，丁二酸1.58%，4种物质检测结果的相对标准偏差（RSD）均＜5%，可见该方法的精确性良好，可满足分析要求。 2.9 加样回收率实验
取已知含量的样品，准确加入定量的标准品。重复进样6次，采用已经优化好的HPLC条件测定各物质总含量，并计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，各物质的RSD在2.26%～5.06%，加样回收率为95%～105%，回收率较好，表明该方法准确可靠，满足分析要求。
通过优化流动相组成及配比、pH值、流速和柱温等条件，建立了一种基于HPLC
的快速测定产酸丙酸杆菌发酵液中丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的方法，具有分析速度快、线性范围宽、灵敏度高等优点，可用于丙酸杆菌发酵生产丙酸实时监控。色谱条件为COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm），紫外检测器，紫外检测波长为210 nm，流动相为K2HPO4缓冲液（0.02 mol/L）和乙腈（0～1%梯度洗脱），流速1.0 m L/min，柱温25℃，检测器温度40℃，进样量10 μL，采用外标法定量。
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