质粒小提试剂盒使用说明书

质粒小提试剂盒I简明步骤（PD1211）

（详细内容请参考英文说明书）

I.

实验前准备

II.

注意事项

RNase A: 使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。

质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash

DNA Wash Buffer*: 使用前请将8 mL (PD1211-00)或48 mL Buffer和Elution Buffer.

(PD1211-01)或216 mL (PD1211-02) or 90 mL (PD1211-转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养03) 96-100% 乙醇加入DNA Wash Buffer。 后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。 Buffer B1: 在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。 在室温下（22-25oC）进行所有离心操作。

切勿直接取冻存的菌种进行培养。

III. 操作步骤

1. 接种新鲜的单个菌落到1-5 mL的LB培养基（含适量抗生素），37oC震荡培养14-16小时。室温下

10,000 x g离心1分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。

注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，第5步离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。

注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（细菌密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD600不超过3.0。

2. 加入250 µL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液或涡流震荡充分悬浮细菌细胞。

注：细菌细胞如果没有充分悬浮均匀，将导致菌体裂解不完全，从而降低产量。

3. 加入 250 µL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。

注：切勿剧烈振荡。静置时间不超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到损伤。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。

4. 加入350 µL Buffer N1, 立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5. 将离心管转至高速离心机，在室温下13,000 rpm离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。 6. 小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中（避免吸起沉淀），室温下13000 rpm离心1分

钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。 7. 可选: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室温下13000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将

离心柱重新放回到收集管中。

注：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）来说是必须的，如HB101, JM101, TG1等；对endA-来说可省

略，如Top 10和DH5a等，请参照英文说明书第3页的表2.

8. 向离心柱中加入500 µL DNA Wash Buffer（确保已加入无水乙醇），室温下，13000 rpm 离心1分

钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。可选步骤：重复步骤“8”。 9. 将离心柱放回高速离心机中，13000 rpm室温下开盖离心2分钟，以彻底去除残留的乙醇。

注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率。

10. 将离心柱转至一个新的1.5 mL离心管中，向DNA柱的正中间加入50~100 µL（体积>50 µL）的

ddH2O（pH在7.0-8.5之间）或Elution Buffer，室温放置2分钟，13000 rpm 离心1分钟，洗脱质粒DNA。

注：提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞。若用于转染内毒素敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内毒素（PD1212）。

IV. DNA浓度及纯度

DNA浓度(µg/mL) = OD260 x 50 x 稀释倍数，OD260/ OD280约为1.7-1.9

;.

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V.

常见问题及解答

1、没有提出质粒或者质粒收获量很低 A、菌种老化：

✓

建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：500的比例进行菌种培养。二次培养细胞最好不要超过16小时。

B、低拷贝质粒：

✓

建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量，如果必要，更换具有相同功能的高拷贝质粒载体。

C、质粒丢失

✓ ✓

建议：某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。

建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。请根据选取的试剂盒，处理相应量的细菌量。

D、裂解不充分

E、Buffer中有沉淀未溶解

✓

建议：Buffer B1和Buffer N1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如有沉淀生成，请置于37oC温育片刻，待溶液澄清后使用。

F、DNA Wash Buffer中未按要求加入乙醇

✓ ✓

建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。

建议：漂洗后，可适当延长离心时间，已尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和超大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。

G、离心柱中乙醇残留 E、洗脱液加入位置不正确，

✓ ✓

建议：洗脱液应加在膜，已取得最好的洗脱效果。

建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0~8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mMTris-HCl）进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0~8.5之间。

F、洗脱液pH值不正确 G、洗脱体积及时间的选择

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建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，可进行二次洗脱。 ✓

建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2~5分钟，更有利于洗脱。

2、质粒纯度不高

A、蛋白质污染OD260/ OD280<1.7

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建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白质。

建议：检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNase A后，Buffer A1/RNase A应该存放在4oC，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNase A。

B、RNA污染OD260/ OD280>1.9 C、基因组DNA污染

✓

建议：加入Buffer B1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入Buffer B1的处理时间最好不要超过5分钟。

3、加样时DNA飘出加样孔外

✓

建议：柱中残留乙醇未除净, 洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在膜上。可再离心或者抽真空。

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