实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株 的诱变和筛选
作者：姚健(201000140136)
同组者：刘新强
指导老师：林建群(教授)
实验日期：2013年5月22日-6月1日
山 东 大 学
微生物大实验报告
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
山东大学生命基地班 姚健 201000140136
摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that there’s no auxotrophic bacteria.
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选
Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening
1引言
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 1.1 营养缺陷型
营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 1.2 紫外线诱变
诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。
紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原
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子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。当细胞中的DNA 分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变[2]。紫外线是应用最早的诱变剂。紫外线诱变具有简便易行、诱变效果良好、可大幅提高菌株的生产特性等优点，迄今仍是实验室和工业上常用的诱变手段。 1.3 缺陷型富集——抗生素法
利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被杀死，得以浓缩。本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。
1.4 缺陷型检出——点植对照法
营养缺陷型的检出是通过一系列培养基实现的。基本培养基（MM）——能满足野生型和原养型菌株最低营养要求的合成培养基。完全培养基（CM）——能满足各种营养缺陷型菌株营养要求的天然培养或半合成培养基。诱变后的菌体经富集培养后，涂布于CM平板上，将长出的菌落按一定排列次序逐个地点种到MM平板、CM平板的相应位置。培养后，在CM上有菌落生长而在MM的相应位置上没有生长的菌落，可能是营养缺陷型。挑取菌体分别接种于MM、CM上进一步复证[3]。
图1：点种方格图
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1.5 缺陷型鉴定——生长谱法
在同一平皿上测定一种营养缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，称生长谱测定[4]。补充培养基（SM）是在MM中有针对地补加某一种或几种营养成分，以满足特定营养缺陷型菌株生长要求的培养基。将所得营养缺陷型菌株的菌悬液与MM混合倾注平板。凝固后，在标定的位置上加少量特定的生长因子（氨基酸、碱基等结晶粉末）。经培养后，出现浑浊生长圈的位置所对应的生长因子即为该营养缺陷型不能合成的营养物质，此菌株即为该物质对应的的营养缺陷型。
2实验材料和方法
2.1材料
2.1.1菌株：大肠杆菌E.coli K12 2.1.2培养基
（1）LB液体培养基（10mL /100mL锥形瓶×4）：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.2，高压灭菌121℃，20min。
LB固体培养基（250mL /500mL锥形瓶×1）：在上述液体培养基中添加,2%的琼脂。 （2）2×LB液体培养基(3mL/试管×2)：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水50ml，pH7.2。 （3）基本培养基：Vogel 50×（即浓缩50倍）：MgSO4·7H2O 10g，柠檬酸100g，NaNH4HPO4·4H2O 175g，K2HPO4·2H2O 599.88g，水600ml。使药品溶解后再定容1000ml。
（4）基本固体培养基：50× 2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g，pH7.0，高压灭菌115℃，20min。
（5）无N基本培养基（5mL /100mL锥形瓶×1）：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖 2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。
（6）2N基本培养基(5mL/试管×1)：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，硫酸铵0.2g，葡萄糖2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。 2.1.3 试剂
蒸馏水、生理盐水（4mL/管×10）
混合氨基酸和混合维生素：氨基酸分7组，其中6组每组6种氨基酸，每种氨基酸等量研细充分混合。第7组是脯氨酸，因为这种氨基酸易潮解，所以单独成一组。
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Ⅰ 赖氨酸 Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ 组氨酸 丙氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 精氨酸 精氨酸 甲硫氨酸 半胱氨酸 胱氨酸 嘌呤 甲硫氨酸 苏氨酸 苏氨酸 谷氨酸 天冬氨酸 嘧啶 半胱氨酸 谷氨酸 羟脯氨酸 羟脯氨酸 甘氨酸 丝氨酸 嘌呤 天冬氨酸 甘氨酸 异亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸 胱氨酸 嘧啶 丝氨酸 缬氨酸 酪氨酸 酪氨酸 脯氨酸 把维生素B1、B2、B6泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素 Ⅸ 空白对照（CK） 表1：混合氨基酸配制
2.1.4 仪器
试管，三角瓶，5mL离心管，移液枪，枪尖，称量纸，玻璃棒，接种环，振荡器，离心机，振荡培养箱，恒温箱，7cm小培养皿1个，9cm培养皿20个，涂布棒，酒精灯，无菌超净台，烧杯，容量瓶，牙签，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，黑布等。 2.2实验方法
2.2.1 菌悬液制备
（1） 用接种环取E.coli K12 一环加入到10ml LB培养液中在恒温振荡培养箱中37℃，150r/min振荡培养过夜。
（2）取0.3ml 菌液转接到10ml LB培养液中，在37℃摇床上振荡培养4—6小时，使细胞处在对数生长期；
（3） 取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3—4 min，离心2次，弃上清液，打匀沉淀，加入4ml无菌生理盐水，充分振荡混匀。 2.2.2 诱变处理
取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌1min，然后打开皿盖照射2.5min，后加入2倍LB培养基3ml，盖上黑布在37℃中黑暗培养12h以上。 2.2.3 诱变后处理
（1）取3ml诱变后菌液加入到离心管中，7000rpm离心3—4分钟，弃上清，再将培养皿中剩余的菌液一起倒入离心管中，7000rpm离心3—4分钟，弃上清，加入4ml生理盐水离心洗涤2次，重悬于3ml生理盐水中，取0.2 ml加入到5ml无氮基本培养基内，置于恒温振荡培养箱中37℃，150r/min振荡培养12小时以上。
（2） 加入2N培养基5ml和适量氨苄青霉素，使菌液中的青霉素终浓度为20μg/ml，37℃下振荡培养。 2.2.4 检出缺陷性菌株
（1） 从培养12、16、24h的菌液中，各自取100μl，分别在LB完全培养基和基本培养基上涂布2个平 板，做好标记，在37℃下培养36—48h。
（2）从上述涂布的平板中选取完全培养基上菌落远大于基本培养基上的一组进行点种。将提前制好的
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方格纸贴于平板背面。用无菌牙签从上述完全培养基上挑取又圆又小的菌落按照先基本后完全的顺序点种在新鲜的平板上。挑取约200个菌落，37℃培养过夜。 2.2.5 复证
挑取LB完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落，在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37℃过夜培养。24小时后仍不长的为缺陷型。 2.2.6 生长谱鉴定
（1）将待测缺陷型接于10ml LB培养基中, 150r/min振荡培养过夜。取3mL菌液加入离心管中，7000r/min离心3—4min，再加入3mL菌液，离心，共加3次菌液，每次3mL，收集菌体，加入生理盐水离心洗涤3次制成3ml菌悬液，取1 ml菌悬液于平皿中央，迅速加入基本培养基，迅速混匀，待平板冷却后做生长谱实验。在平板的背面将小平板划分为9个区域。将混合物质轻轻抖落在标定位置，注意不能出现可见的粉末颗粒。点好样后等上一段时间待营养物质渗入培养基中，再倒置放于培养箱中37℃培养。 （2）观察培养结果，根据生长情况以及组合分析，确定是何种缺陷型。
3 实验结果及分析
3.1 营养缺陷型浓缩
3.1.1 青霉素浓缩法处理大肠杆菌不同取样时间生长情况
图2：12h取样时野生菌和突变菌的涂布情况 图3:16h取样时野生菌和突变菌的涂布情况 5
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图4:24h取样时野生菌和突变菌的涂布情况
通过观察图2、图3、图4，发现随着培养时间的增加，完全培养基和基本培养基上的菌落数逐渐下降。观察12、16、24h菌液涂布后培养的菌落生长情况，在12h、16h和24h的基本和完全培养基上都有菌落长出，12h、16h时涂布的平板菌浓很大。由于12h培养时间过长，很难找单菌落；16h的完全培养基中的菌落数与基本培养基上菌落数的比例相较24h的要小，说明在24h时营养缺陷型菌株有最大富集度。挑取24h的完全培养基上的单菌落以先基本后完全的方式进行点种，37℃培养过夜，观察菌落生长情况。
3.2营养缺陷型检出和鉴定
3.2.1 营养缺陷型检出
图5：点种平板结果（左为基本培养基，右为完全培养基）
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在9、31、49、56、78、81、109和115号格子对应的完全培养基生长了菌落，而相同位置的基本培养基却没有菌落生长，因此可以暂认为这些菌株为营养缺陷型菌株。
实际比较选择过程中，很难确定基本培养基上是否长出菌落，这可能是因为点钟过程中用力过大，在培养基上留下一个印，光线使得很难判断出到底是长出来的菌落还是戳的印，所以就需要将认为是发生了突变的菌株进行复证。 3.2.2 营养缺陷型复证
观察图6，9、31、49、56、78、81号菌株在完全培养基和在基本培养基上都生长，说明这6个菌株不是营养缺陷型菌株，表明之前的点种检出营养缺陷型操作产生了假阳性反应。而这6个菌株之所以在点种实验步骤中不在基本培养基上生长可能是因为菌体在基本培养基上生长缓慢，而且点种接种量小，培养时间短，所以形成的菌落很小，加之点种前可能划破了平板表面，从而影响观察并造成误差。109、115号菌株在基本培养基上不长，因此可能为诱变菌株。最终选取了109、115号作为生
长谱鉴定备选菌，下图为对109和115号菌株的生长谱鉴定结果。
图6:营养缺陷型的划线复证（左：完全培养基 右：基本培养基） 7
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3.3生长谱鉴定结果
图7:109号菌株生长谱鉴定结果
图8:115号菌株生长谱鉴定结果
观察图7和图8，两个菌株在两个平板上都长满了，可以知道 109、115号菌株营养缺陷型生长谱鉴定的结果是混合氨基酸组和混合维生素组均有菌落长出，基于这个结果，现分析如下：
（1）菌株长满平板有一种可能，那就是含有它不能自己合成的氨基酸的混合氨基酸添加过量，渗透到了整个平板。平板这时候可近似看做是完全培养基，所以这时即使是有营养缺陷型也鉴定不出来。
（2）它们都是原养型的菌，但是在复证的时候可能由于某种未知的原因导致其没有在基本培养基上生长。之后的生长谱测定中，可能由于初始温度稍高之类的差异导致了原来限制生长的因素消失，于是普遍都能生长。
（3）菌株还可能发生了回复突变，但这种情况出现的概率太小。
（4）109、115号菌悬液制作过程中未能洗净其中的完全培养液，使得营养充分，而在平板上生长， 导致实验的失败。
（5）基本培养基加入氨基酸后（外界高渗溶液）导致细胞膜通透性增加，而该菌发生营养缺陷
的原因刚好是转移酶受到了抑制。因此酶的作用底物能够顺利到进入细胞内被进一步合成利用。
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4 注意事项
（1）紫外诱变需要避光，以防光修复作用。
（2）在进行生长谱测定洗涤菌液时，要将离心后的上清液全吸净，若有LB培养基成分则会促进菌体 生长，从而不能确定是否有缺陷型菌种。
（3）在倾注平板时，培养基温度不能太高，也不能太低。太高则容易杀死细菌，太低则容易凝固，导致培养基不均匀，不能铺成平板，也能导致菌液不均匀，从而不能确定是否有缺陷型菌株产生。 （4）实验过程中要严格控制无菌，在菌落的选取、划线培养、菌悬液的吸取、接种等环节都要进行严格的无菌操作，任何一步的杂菌污染都会对最终的实验结果造成严重影响。
（5）紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中应避免人体暴露在紫外线中。各种器具、培养基及需加入培养基中的试剂均需灭菌。
（6）无N和2N培养基的使用，是为了浓缩营养缺陷型。 （7）点种时要先基本后完全，并注意不要划破培养基表面。 （8）复证是必须的，不可轻视，点种容易出现假阳性反应。
（9）营养缺陷型鉴定时要使用倾注平板，不能采用涂布的方式，倾注平板能够较好的保证菌体能够分布的均匀。而且如果涂布的话，在培养基表面容易留下水迹，造成了氨基酸的溶解扩散，使实验失败。 （10）生长谱鉴定时，点的氨基酸量不能太多，防止扩散混杂。
（11）在做检出缺陷性菌株时，用无菌牙签从上述完全培养基上挑取又圆又小的菌落按照先基本后完全的顺序点种在新鲜的平板上。
5 讨论
本次实验以大肠杆菌E.coli K12为实验菌株通过紫外线诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定菌株的缺陷型类型。由于基因突变具有的不定向性、低频性的固有因素，以及操作和实验条件有限等因素，通过诱变育种得到想要的新菌种需要高通量，工作量大而且不易得到预期的菌种，因此实验未能得到预期的营养缺陷型菌株。
在青霉素处理时，其时间分为12h、16h和24h，因为在这个过程中处理时间也起到重要的作用。青霉素处理的时间过短就不能有效地杀死大部分我们不需要的细胞，而处理时间过长则所得到需要的缺陷型菌株获得率会大大下降。
倾注培养法进行生长谱的鉴定有其优点。由于氨基酸没有经过灭菌处理，而且在氨基酸点样过程中很容易发生受杂菌污染，这样就很有可能导致培养基的表面有杂菌菌落产生。比如这时候采用涂布法，那极有可能引发实验的干扰，产生假阳性。而用倾注法的菌落不容易扩散，能够将菌落限定在特定的区域，氨基酸等补充营养物质扩散时，要向培养基内部扩散，如果涂布平板则菌分布在表面，而 倾注平板法菌主要分布在培养基内部，这样缺陷型菌接触补充营养物质的机会将更大，细菌可以利用外来的氨基酸，更容易生成肉眼可见的菌落。菌落生长圈就会出现在培养基内部，这样我们只观察透明培养基的内部的生长圈情况就可以了。
而对于倾注法存在的问题，第一，倾注平板容易造成平板不平，或者不均，影响菌的生长和观察。 第二，倾注平板时容易将菌杀死，而对于这个情况的掌控，只能依靠人为的感觉。第三：它还是没能 更高程度地避免染菌，因此也要求我们的无菌操作精度要高。
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7 实验总结及个人体会
虽然说我们最后没有鉴定出突变菌株属于何种营养缺陷型，略感遗憾，但是整个过程的效果都不错，包括培养、诱变、富集、筛选、复证等等，都达到了预期的效果。本实验的每一个步骤都值得去深思，考虑它的前因后果。具体的实验过程非常的锻炼人，基本包含了大学微生物实验能用到的技术，对于提升实验技能大有帮助。本实验的自由度较高，指导老师只进行有限的讲解，给予我们极大的独立思考和完成实验的空间，注重过程，不苛求结果。有些操作丝毫不起眼，但作用却很大，无菌操作 和生长谱测定中加混合氨基酸的量一定要少就需要引起重视。总而言之，这次微生物大实验让我获益良多，在实验技能和思维上都有了很大的提高，最后还要感谢老师的悉心指导和付出，帮助我们顺利地完成本学期的微生物大实验课程！
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