*CN101709298A*
(10)申请公布号 CN 101709298 A(43)申请公布日 2010.05.19
(12)发明专利申请
(21)申请号 200910201072.1(22)申请日 2009.12.14
(71)申请人上海市农业科学院
地址201106 上海市闵行区北翟路2901号(72)发明人唐雪明 王金斌 赵凯 谭芙蓉
吴潇 朱宏 陶世如 蒋玲曦王利刚 刘华(74)专利代理机构上海开祺知识产权代理有限
公司 31114
代理人费开逵(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 6 页
(54)发明名称
一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法(57)摘要
本发明公开了一种用于评价植物根系土壤微生物群落多样性的微生物基因组DNA提取方法，在细胞裂解以前对样品进行前处理，将胞外DNA及腐殖质进行去除，避免了纯化步骤存在腐殖质去除困难和DNA回收率低的问题。本发明提取过
氯仿，减少了对实验人员的身体健康程不使用酚、
伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。所提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，以评价植物根系微生物群落多样性。
CN 101709298 ACN 101709298 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向0.1-5g土壤样品中加入1.5-10mL样品浸洗液A，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-10分钟，弃去上清液，重复3次；
(2)向由上述步骤(1)得到的土壤中加入1.5mL样品浸洗液B，冰上放置5-30分钟，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-8分钟，弃去上清液，重复3次；
(3)向由上述步骤(2)得到的土壤中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸缓冲液C到样品中，漩涡震荡2-10分钟；
(4)向由上述步骤(3)得到的土壤悬浊液加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000rmp离心5-10min，沉淀碎片；
(5)将由上述步骤(4)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质；
(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min；
(7)将由上述步骤(6)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；
(8)将由上述步骤(7)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。
(9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次；
(10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rmp离心1-5min；
(11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rmp离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。其中洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述样品浸提液A由20-400mM Tris、15-200mM EDTA、50-250mM NaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝8.0-10。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述样品浸提液A优选由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝9.5。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述样品浸提液B为60-95wt％的乙醇。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述浸提液B优选为80wt％乙醇。6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述细胞裂解液D由1wt％SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA、0.1wt％PVP组成，pH＝8.0。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述胞裂解液D优选由1wt％SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0.1wt％PVP组成，pH＝8.0。
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8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt％冰醋酸组成。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E优选由3M KAc、4wt％冰醋酸组成。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述DNA联接液F由6-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH为4.5-6.0。
11.根据权利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述DNA联接液F优选由8M异硫氰酸胍、500mM醋酸钾组成，pH＝5.5。
12.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗涤液G由5.5M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成。
13.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗涤液H由70wt％乙醇、200mM醋酸钾组成，pH＝5.0。
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一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取
方法
技术领域
[0001]
本发明涉及一种用于评价植物根系土壤微生物群落多样性的DNA提取方法，具体
涉及一种从根系土壤中提取微生物基因组DNA的提取方法。
背景技术
[0002] 大多数土壤微生物似乎极其适应它所处的环境并在一般的实验室条件下是不能培养的。从自然环境中提取基因组DNA是非常有用的方法，可用于检测不可培养的微生物，跟踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行为；也可以用来揭示植物根际土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化。这就要求从环境样品中抽提和纯化土壤微生物基因组DNA。
[0003] 基因组DNA提取的主要目标是获得最高的DNA回收，从而从微生物群落中获得最具代表性的DNA，并进行进一步的分子操作(如PCR、SSCP、DGGE、TGGE、AFLP等)。但是来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉，腐殖质有类似于核酸的物理化学性质。因此，腐殖质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同被萃取。腐殖酸直接影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化和细菌转化等。在大多数宏基因组研究中，分离出不含腐殖质的宏基因组DNA，仍然是一个难题。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了DNA的损失。大部分基因组DNA提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA吸附于土壤表层，土壤提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切。[0004] 因此，需要研究适用于植物根际土壤微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，以解决使用常规方法所获得的DNA样品存在腐殖酸等PCR抑制物以及细胞裂解率低、DNA损失严重等问题。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于评价植物根系土壤微生物群落多样
性的微生物基因组DNA提取方法，以解决在于土壤微生物细胞裂解后，由于腐殖质有类似于核酸的物理化学性质，纯化步骤存在腐殖质去除困难和DNA回收率低等问题。[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
[0007] 所述用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，包括以下步骤：[0008] 所述用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，包括以下步骤：[0009] (1)向0.1-5g土壤样品中加入1.5-10mL样品浸洗液A，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-10分钟，弃去上清液，重复3次。
[0010] (2)向由上述步骤(1)得到的土壤中加入1.5mL样品浸洗液B，冰上放置5-30分钟，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-8分钟，弃去上清液，重复3次。[0011] (3)向由上述步骤(2)得到的土壤中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直径为4mm的玻
[0005]
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璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸缓冲液C到样品中，漩涡震荡2-10分钟。[0012] (4)向由上述步骤(3)得到的土壤悬浊液加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000rmp离心5-10min，沉淀碎片。
[0013] (5)将由上述步骤(4)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质。
[0014] (6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。
[0015] (7)将由上述步骤(6)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。
[0016] (8)将由上述步骤(7)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。
[0017] (9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。[0018] (10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rmp离心1-5min。
[0019] (11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rmp离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。[0020] 其中，上述提取方法中，所述样品浸提液A由20-400mM Tris、15-200mMEDTA、50-250mM NaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝8.0-10，优选由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝9.5。[0021] 所述浸提液B为60-95wt％的乙醇，优选80wt％乙醇。[0022] 所述胞裂解液D由1wt％SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA、0.1wt％PVP组成，pH＝8.0，优选由1％SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0.1％PVP组成，pH＝8.0。
[0023] 所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt％冰醋酸组成，优选由3M KAc、4％冰醋酸组成。
所述DNA联接液F由6-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH为4.5-6.0，
优选由8M异硫氰酸胍、500mM醋酸钾组成，pH＝5.5。[0025] 所述洗涤液G由5.5M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成。[0026] 所述洗涤液H由70wt％乙醇、200mM醋酸钾组成，pH＝5.0。[0027] 所述洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。[0028] 本发明的提取方法，具有以下优点：
[0029] 1.本发明所述的DNA提取方法操作简单，不需要较为复杂的设备，常规生物化学或微生物学实验室就可完成；并且涉及的试剂均为常规分析、分子生物学使用的试剂，相对于市场上的试剂盒成本低。
[0030] 2.本发明所述的DNA提取方法是在细胞裂解以前对样品进行前处理，将胞外DNA
[0024]
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及腐殖质进行去除，避免了纯化步骤存在腐殖质去除困难和DNA回收率低的问题。[0031] 3.本发明所述的DNA提取方法适用性强，提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，来评价植物根系微生物群落多样性。[0032] 4.提取过程不使用酚、氯仿，减少对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。具体实施方式
[0033] 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。[0034] Tris(三羧基甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NaCl、乙醇、SDS(十二烷基硫酸钠)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、TEEPOL(仲烷基硫酸钠与烷基苯磺酸钠的混合物)、KAc(醋酸钾)、冰醋酸、异硫氰酸胍、醋酸钾、柠檬酸钠等试剂均为国产分析纯药品。[0035] 实施例1
[0036] (1)向0.5g西甜瓜根系土壤样品，加入1.5mL样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。[0037] (2)加入1.5mL样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。
[0038] (3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μl磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。
[0039] (4)加入122μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟。13000rmp离心10min，沉淀碎片。
[0040] (5)将上清转移到一个干净的离心管中，加入250μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5分钟，13000rmp离心5min。[0041] (6)将上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。
[0042] (7)将混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置2min。6000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。
[0043] (8)将结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。[0044] (9)将结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。[0045] (10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。[0046] (11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-2μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。
[0047] 以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。[0048] 用分光光度计测定OD230、OD260和OD280，结果表明OD260/OD230＝2.01，OD260/OD280＝1.86，接近于标准值(注：OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价植物根系微生物群落多样性。
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实施例2
[0050] (1)向0.5g草莓根系土壤样品，加入1.5mL样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。[0051] (2)加入1.5mL样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心6分钟，弃去上清液，重复3次。
[0052] (3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μl磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。
[0053] (4)加入122μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟。13000rmp离心10min，沉淀碎片。
[0054] (5)将上清转移到一个干净的离心管中，加入250μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5分钟，13000rmp离心5min。[0055] (6)将上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。
[0056] (7)将混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置2min。6000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。
[0057] (8)将结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。[0058] (9)将结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。[0059] (10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。[0060] (11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。
[0061] 以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。[0062] 用分光光度计测定OD230、OD260和OD280，结果表明OD260/OD230＝2.04，OD260/OD280＝1.83，接近于标准值(注：OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价植物根系微生物群落多样性。[0063] 实施例3
[0064] (1)向0.5g水稻根系土壤样品，加入1.5mL样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。[0065] (2)加入1.5mL样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心7分钟，弃去上清液，重复3次。
[0066] (3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μl磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。
[0067] (4)加入122μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟。13000rmp离心10min，沉淀碎片。
[0068] (5)将上清转移到一个干净的离心管中，加入250μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5分钟，13000rmp离心5min。
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(6)将上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，
用手颠倒混匀1-5min。
[0070] (7)将混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置2min。6000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。
[0071] (8)将结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。[0072] (9)将结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。[0073] (10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。[0074] (11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。
[0075] 以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。[0076] 用分光光度计测定OD230、OD260和OD280，结果表明OD260/OD230＝2.02，OD260/OD280＝1.83，接近于标准值(注：OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价植物根系微生物群落多样性。[0077] 实施例4
[0078] (1)向0.5g糯玉米根系土壤样品，加入1.5mL样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。[0079] (2)加入1.5mL样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心8分钟，弃去上清液，重复3次。
[0080] (3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μl磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。
[0081] (4)加入122μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟。13000rmp离心10min，沉淀碎片。
[0082] (5)将上清转移到一个干净的离心管中，加入250μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5分钟，13000rmp离心5min。[0083] (6)将上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。
[0084] (7)将混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置2min。6000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。
[0085] (8)将结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。[0086] (9)将结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。(10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。[0088] (11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在
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膜中央小心加入30-2μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。
[0089] 以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。[0090] 用分光光度计测定OD230、OD260和OD280，结果表明OD260/OD230＝2.07，OD260/OD280＝1.82，接近于标准值(注：OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价植物根系微生物群落多样性。[0091] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
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