遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） １８（５）： ４６－４８ １９９６综述提高ＰＣＲ扩增大ＤＮＡ片段的特异性和产量卢一凡邓继先肖成祖马清钧浑事医学科学院生物工程研究所，北京１０００７１）Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ ａｎｄ Ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＰＣＲ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｎｇＬｏｎｇ ＤＮＡ ＦｒａｇｍｅｎｔＬｕ Ｙｉｆａｎ Ｄｅｎｇ Ｊｉｘｉａｎ Ｘｉａｏ Ｃｈｅｎｇｚｈｕ Ｍａ Ｑｉｎｇｊｕｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００７１）聚合酶链式反应（（ＰＣＲ）技术虽仅产生数年，却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域．它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或ＤＮＡ片段，用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面．目前，ＰＣＲ扩增ＤＮＡ片段长度可达到近５０ｋｂ，这在生物学研究特别是在基因组图谱绘制和测序中将起到革命性作用（’，，，尽管ＰＣＲ技术有诸多优越性，但扩增大ＤＮＡ片段却并非易事，特别是从复杂的基因组ＤＮＡ作为模板更增加其难度．当前利用ＰＣＲ扩增大的ＤＮＡ片段大多局限于３－４ｋｂ ＂），尽管已有一些扩增出较大的ＰＣＲ产物的报道〔９， １５， １６， ２０）但对最佳扩增条件所做的探索性研究不多．也难以如标准ＰＣＲ那样推出一些标准化的条件．本文根据现有文献对一些影响扩增大ＤＮＡ片段的因素加以分析，并提出了提高扩增特异性和产量的可能的途径。１模板在常规ＰＣＲ中，对模板的要求并不严格。对不同来源的组织生物样品都已成功地进行了ＰＣＲ．然而对于扩增大片段ＤＮＡ来说，情况却并非如此．首先是要求模板的完整性。许多研究都已证明，在扩增长度达１０－１５ｋｂ时，质量完整的模板与之有很大关系．从复杂的基因组ＤＮＡ片段来看，其片段的长度最小应在５０ｋｂ，对其采用低熔点琼脂糖回收可获得更为理想的扩增效果（ｌ８）．其次，对如此之大的ＤＮＡ特别是复杂的基因组ＤＮＡ模板进行扩增，需要延长变性时间或使用较高的变性温度，以及提高有效引物退火的温度和时间，后者在未知模板长度和序列特性（如Ｇ＋Ｃ含量）或存在有二级结构时尤为重要．在提高温度时，较大的ＤＮＡ模板导致出现更多的对脱嗦吟和脱氨基的敏感位点出现（７－８），因而有时导致ＰＣＲ扩增失效，而在反应体系中加人甘油和二甲基亚枫可以使变性温度有所降低，或缩短变性的时间，减少对模板的损害〔幻．模板浓度直接影响扩增的重复性、特异性和扩增的产量．过量的模板导致错配机率增高，从而非特异性增大．模板量太少，扩增高分子量、低拷贝数的ＰＣＲ产物，则重复性不佳，而且常常ＰＣＲ产物的量不足以检测‘’”．许多研究者试验扩增０．１－ ＩＯＯ ｎｇ的模板（１，１０，１２，１Ｅ－１７，２０），结果表明，对复杂基因组ＤＮＡ扩增时，模板量至少要达到１００ｎｇ水平（９）。２缓冲液体系标准ＰＣＲ使用的缓冲液含有ＩＯｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ ＂ ＨＣｌ（ｐＨ８．３－８．４， ２０－２５ ＩＣ ），它使ＰＣＲ获得成功的原因是这一体系致使反应达到最佳引物—模板结合的体系。然而，在扩增大片段ＤＮＡ时却并非最佳．Ｃｈｅｎｇ等（１９９４）５期卢一凡等：提高ＰＣＲ扩增大ＤＮＡ片段的特异性和产量４７为确定扩增高分子量ＰＣＲ产物的最佳缓冲液体系，将Ｔｒｉｓ ＂ ＨＣｌ从１０ｍｍｏｌ ／ Ｌ提高到２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ，浓度提高２．５倍，获得了较好的扩增结果．这表明，对于扩增较大ＤＮＡ片段时，由于延伸时间的加大，也需要较大的缓冲能力．在标准ＰＣＲ中某些共溶剂的使用已能使扩增效果得以改善〔”〕，对于扩增大片段ＤＮＡ也同样有效．在标准ｒＴａｑ ＰＣＲ缓冲液中加入８％的甘油能使扩增达到１０－１９ｋｂ，甘油可以影响大片段扩增，主要是通过（（１）提高聚合酶的热稳定性，如ｒＴａｑ聚合酶在９５－９７．５℃时，在甘油存在下，稳定性可以提高两倍多；（２）有效地降低熔点和解链温度（每１０％甘油可以降低２．５－３ｒ－），这有助于变性模板和增大引物退火的特异性（（２）．甘油和二甲基亚矾结合使用比单独使用甘油的效果更好。添加１－３％二甲基亚矾、８％甘油，或两者分别为５％时，可有效地从基因组文库中扩增２５－３４ｋｂ片段．当加人５％二甲基亚讽和６－７％甘油时，扩增达到３５－４２ｋｂ．然而，较低水平的二甲基亚讽却并不太理想，１％的二甲基亚矾和８％的甘油，仅扩增出２６ｋｂ②，这可能是由于二甲基亚矾与甘油不一样，它降低了ＤＮＡ聚合酶的热稳定性，同时功能性地降低熔点和解链温度（每１０％二甲基亚讽降低５．５－６ｒ－） １３１，可见，扩增大ＤＮＡ片段，提高产量和特异性并不是单单通过升高变性和退火温度来达到的，甘油和二甲基亚矾的有效结合也起一定的作用。已报道二甲基亚讽可以加速链的重新复性，并给予ＤＮＡ抗有害物质的作用或抗链断裂的热稳定性（‘〕．它对于富含有Ｇ十Ｃ区的片段也是有效的川〕．然而甲酞胺应用于这一体系却难以奏效．３引物扩增特异性和有效性的最基本因素是获得最佳的引物设计．常规ＰＣＲ引物设计的诸多原则也同样适用于扩增大片段ＤＮＡ．许多扩增大片段ＤＮＡ的文献都已表明，引物最佳长度是在１８－２５ｂｐ （１， １０， １２， １‘一’７， ２０）Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等（１９９３）指出，当对复杂的基因组ＤＮＡ或对富含Ｇ＋Ｃ的已知片段扩增时，增加引物的长度可对其提供附加稳定性．每增加一个固定的核昔酸将提高特异性近４倍〔４）．对于扩增大片段ＤＮＡ来说，引物长度在２０－２３ｂｐ， ５２－６０％的Ｇ十Ｃ含量、采用６８℃的退火和延伸温度是较成功的引物．而稍长一些的引物（如２８－３０ｂｐ）对于从噬菌体文库中扩增来说，并非是最好的（（２）．在引物的设计中，常规ＰＣＲ一般要求每个引物的解链温度应是平衡的，但差别并不重要．但在扩增大ＤＮＡ片段中，在延伸时间增加的情况下，引物对的解链温度相差在１℃之内时，该引物设计最佳．超过此范围，即使解链温度的微小差异，也将增大错配．４酶的种类与活性现有的一些报道已对应用于扩增大ＤＮＡ片段的几种ＤＮＡ聚合酶做了评价（１， １０，”一‘６）．具有５＇－３，外切活性的酶与３＇－５＇外切活性或无外切活性的酶比较时，前者在扩增大ＤＮＡ片段上表现出卓越的性能．ｒＴａｑ和ｒＴｔｈＤＮＡ聚合酶比Ｔｕｂ（局限于１９－２１ｋｂ）， Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ－）（局限于９ｋｂ）能获得更高的产量（２）．当比较几种ＤＮＡ聚合酶时，一些研究人员都发现，ＨｏｔＴｕｂＤＮＡ聚合酶也可产生达６－１５．６ｋｂ的可靠ＰＣＲ产物，ｒＴｔｈＤＮＡ聚合酶表现最可靠，能提供最稳定的成功性（（２，１５），而ＡｍｐｌｉＴａｇＤＮＡ聚合酶和天然ＴａｇＤＮＡ聚合酶用于扩增大ＤＮＡ片段时，特异性和重复性则并不理想．核普酸的错配降低大ＤＮＡ片段的扩增效率，３＇末端碱基错配将较早地导致末端终止合成（”，对于Ｔａｑ酶来说，即使在估计的很低水平错配（１００ ０００－５０ ０００ｂｐ出现一个错误），将影响大于ｌＯｋｂ ＤＮＡ片段的扩增〔２）．些热稳定的３＇－５＇外切核酸酶活性可以消除这样的碱基错误配对，使得充分发挥聚合酶的活性以完成链的合成．现已对这类具有３＇－５＇外切活性的酶扩增大片段ＤＮＡ加以研究。但一些报道发现，这类酶如Ｖｅｎｔ或ｐｆｕＤＮＡ聚合酶未能在长度上稳定地产生大于９ｋｂ的特异性片段〔１２，１５）。一些研究发现，ｒＴｔｈＤＮＡ聚合酶对于扩增大ＤＮＡ片段具有较可靠的结果〔’““〕，而将之与具有３＇－５，外切活性的酶混合使用将更为有益（３， １６）。少量的３＇－５＇酶活性可以校正核昔酸的错误配对，从而提高酶的活性效率．４８遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） １９９６ １８０已经证实，在扩增大ＤＮＡ片段时，多酶合用的结果可以发挥酶的活性而并不抑制外切活性．５循环参数ＰＣＲ反应的一个循环由三步组成，一个典型的循环是９０－９７℃变性、４０一一６０℃退火、７０－７５℃延伸所构成。对于获得最佳ＰＣＲ来说，在每一步中使用的时间和温度依赖于引物一模板体系的性质．变性时间的选择是扩增大ＤＮＡ片段成功的因素之一可以想象得到，较长的变性时间可以获得较好的扩增结果．在９５℃时，Ｔａｑ酶仍保持有５０％初始活性，这可以在整个２５－３０个循环中提供足够的酶活性（３）．然而，有人指出，在适度的变性温度下（如９４ｒ－），应该选择较短的时间，以减少ＤＮＡ的损伤如脱嚎吟等现象的发生，但这一点却不能提高产量．退火温度的选择是基于引物解链温度和估计的模板长度以及Ｇ＋Ｃ含量来考虑的，当模板长度未知时，可以利用Ｒｙｃｈｌｉｋ等（（１９９０） （２０）提出的方程式计算，以确定出最佳退火条件，Ｇ十Ｃ含量往往根据普通研究的基因组区核普酸含量估计．在对大ＤＮＡ片段扩增时，选择６８℃的退火温度是最佳的，在此退火温度下，比较几种ＤＮＡ聚合酶，几乎每种酶的扩增产物都很令人满意（（２）．完整的链合成对于获得理想的ＰＣＲ产物是必不可少的，它需要引物附在完整的模板之上，通过足够的延伸时间和附加的校正酶的作用得以完成．Ｔａｑ酶的延伸在２２℃是０．２５核昔酸／秒，在３７℃是１．５核昔酸／秒，在５５１ｒ是２４核昔酸／秒，在７０℃则大于６０核昔酸／秒，在７５－８０℃时是１５０核昔酸／秒（４）、因此，在一般情况下选择延伸温度如７０－７２ｒ－， Ｔａｑ酶将大于３．５ｋｂ／分．而做为一般规律，延伸时间在一分钟／ｋｂ，足以产生所预测的ＰＣＲ产物，这一点也适合于其他的酶．尽管如此，但延伸时间的长短仍是决定扩增大ＤＮＡ片段产量的重要因素．在反应的后几个循环中，利用ＰＣＲ仪的可编程序自动增加延伸时间，已证实在扩增大ＤＮＡ片段是一种有效手段（”，’‘，．与恒定的１５分钟的延伸时间相比，在后几个循环中，每循环增加１５－２０秒，产物非特异性少，并且产量有相当大的提高．在后几个循环中，产物开始大量积累，因而减少单位时间每个模板上酶的摩尔数。而此时延伸时间的加大则提高了合成大ＤＮＡ片段的可能性〔２）．无论这‘一推论正确与否，采用自动延伸时间能更为稳定地扩增出理想的大片段产物。参〔１〕（２〕（３〕（４〕（５〕（６〕（７〕〔８〕考文献Ｂａｒｎｂｓ Ｗ Ｍ， １９９４． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：２２１６．Ｃｈｅｎｇ Ｓ， Ｆｏｃｋｌｅｒ Ｃ， Ｂａｒｎｅｓ Ｗ Ｍ ｅｔ ａｌ， １９９４． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ）． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：５６９５．Ｃｈｅｓｔｅｒ Ｊ Ｇ， ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｋ Ｄ Ｒ， １９９３，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０９： ２８４．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ Ｗ， Ｌｏｗｅ Ｊ， ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ Ｇ Ｓ， １９９３． ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐｐｌｉｃ， ３：５３０．Ｅｒｌｉｃｈ Ｇｅｌｆａｕｅｌ Ｄ， ａｎｄ Ｓｉｎｉｎｓｋｙ Ｊ， １９９１． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２：１６４３．Ｅｓｃａｒａ Ｊ Ｆ， ａｎｄ Ｈｕｔｔｏｎ Ｊ Ｒ， １９８０． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， １９：１３１５．Ｈｕａｎｇ Ｍ Ｍ， Ａｒｎｈｅｉｍ Ｎ， ａｎｄ Ｇｏｏｄｍａｎ Ｍ Ｆ， １９９２． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０： ４５６７．Ｉｉｎｄａｈｌ Ｔ， ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ Ａ， １９７２． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１：３６１０．〔９〕Ｊｅｆｆｒｅｙｓ Ａ Ｌ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｖ， ＮｅｕｍａｎｎＲｅｔ ａｌ， １９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６： １０９５３．？？〔１０） Ｋａｉｎｚ Ｐ， Ｓｃｈｍｉｅｄｌｅｃｈｎｅｒ Ａ， ａｎｄ Ｓｔｒａｃｋ Ｂ， １９９２． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ，，２０２： ４６．（１１〕Ｋｏｒｇｅ Ｂ Ｐ， Ｇｅｎ Ｓ Ｑ， Ｍｃｂｉｒｄ Ｏ Ｗ ｅｔ ａｌ， １９９２． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９： ９１０．（１２） Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｂ Ｒ， Ｋｅｒｓｎｌｙｔｅ Ｄ， Ｂｒｉｒｕｎ Ｉ ｅｔ ａｌ， １９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９： ６１７７．（１３） Ｋｗｏｋ Ｓ， Ｋｅｌｌｏｇ Ｃ Ｅ， Ｍｃｋｉｎｎｅｙ Ｎ ｅｔ ａｌ， １９９０． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８：９９９．（１４） Ｍａｇａ Ｅ Ａ， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｔ， １９９１．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １１：１８５．（１５） Ｏｈｌｅｒ Ｌ， ａｎｄ Ｒｏｓｅ Ｅ Ａ， １９９２． ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐｐｌｉｃ， ２： ２１．（１６） Ｏｈｌｅｒ Ｌ， Ｚｏｌｌｏ Ｍ，ａｎｄ Ｍａｎｓｉｅｌｄ Ｅ， １９９３． ＰＣＲ Ｍｅｔｈ． Ａｐｐｌｉｃ， ３： ８５．（１７） Ｐｏｎｃｅ Ｍ Ｒ， ａｎｄ Ｍｉｃｏｌ），１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０： ６２３．（１８） Ｒｏｓｅ Ｅ＾，Ｇｌａｓｅｒ Ｔ，｝ Ｊｏｎｅｓ Ｃ ｅｔ ａｌ， １９９０． Ｃｅｌｌ， ６０：４９５．（１９） Ｒｏｓｅ Ｅ Ａ， １９９１．ＦＡＳＥＢ Ｊ， ５： ４６．（２０） Ｒｙｃｈｉｉｋ Ｗ， Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｗ Ｊ， ａｎｄ Ｒｈｏａｄｓ Ｒ Ｅ， １９９０． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８： ６４０９．本文于１９９５年Ｉ１月１７日收到，１９９６年Ｉ月２３日修回．