(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112625140 A(43)申请公布日 2021.04.09
(21)申请号 202011526321.7(22)申请日 2020.12.22
(71)申请人 北京致力生科科技有限公司
地址 102600 北京市大兴区庆丰西路29号
A61P 1/02(2006.01)
A61P 9/14(2006.01)A61P 1/00(2006.01)A61P 1/04(2006.01)
(72)发明人 甘向东 龙民慧 李飞 张森 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 董大媛(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)C12N 15/62(2006.01)A61K 38/18(2006.01)A61K 47/64(2017.01)A61K 47/65(2017.01)A61P 29/00(2006.01)A61P 17/02(2006.01)
(54)发明名称
一种PEP-1-G4S-KGF2融合蛋白及其编码基因和应用(57)摘要
本发明提供了一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域，所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。采用本发明提供的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白提高了穿透上皮细胞的细胞膜能力，提高了角质细胞生长因子2达到损伤部位组织的有效浓度。
权利要求书1页 说明书8页序列表5页 附图3页
CN 112625140 ACN 112625140 A
权 利 要 求 书
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1.一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白，其特征在于，所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备提高穿透细胞膜能力的药物中的应用。
4.权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复上皮组织损伤的药物中的应用。
5.权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞增殖的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞包括上皮细胞。
7.权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞迁移的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞包括上皮细胞。
溃疡和物理化9.权利要求1所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复急慢性炎症、
学烧伤的药物中的应用。
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CN 112625140 A
说 明 书
一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用
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技术领域
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术[0002]角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor 2,KGF2)是成纤维细胞生长因子家族中具有肝素结合特异性的一员，又称为FGF10，由208个氨基酸残基组成，其N端是由39个疏水残基构成的信号肽序列。KGF2主要由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，通过间充质‑上皮相互作用的方式，主要作用于表达于上皮组织的特异性受体FGFR2‑Ⅲb，有效促进上皮细胞的增殖、移行、分化。有文献报道，KGF2对于多种损伤如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等的修复有重要作用，尤其对放、化疗引起的口腔黏膜炎、静脉溃疡、溃疡性结肠炎等难治性上皮组织损伤作用显著。KGF2还参与和调控四肢、肺支气管、牙齿、胰腺、脑垂体、眼睑和皮肤及下颌腺等器官的形成和发育。但是KGF2渗透到上皮细胞的深层部位的量有限，如何提高KGF2渗透的浓度还没有详细的研究报道。发明内容
[0003]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用，采用本发明提供的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白提高了穿透上皮细胞的细胞膜能力，提高了角质细胞生长因子2达到损伤部位组织的有效浓度。[0004]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0005]本发明提供了一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白，所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]本发明还提供了一种编码上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备提高穿透细胞膜能力的药物中的应用。
[0008]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复上皮组织损伤的药物中的应用。
[0009]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞增殖的药物中的应用。[0010]优选的，所述细胞包括上皮细胞。
[0011]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞迁移的药物中的应用。[0012]优选的，所述细胞包括上皮细胞。
[0013]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复急慢性炎症、溃疡和物理化学烧伤的药物中的应用。
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CN 112625140 A[0014]
说 明 书
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本发明提供了一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用，所述PEP‑1‑
G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。采用本发明提供的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白提高了穿透上皮细胞的细胞膜能力，利用穿膜肽PEP具有携带大分子渗透生物膜结构的功能，提高了角质细胞生长因子2达到损伤部位组织的有效浓度。附图说明
[0015]图1为PEP‑1‑G4S‑KGF2融合序列酶切鉴定图；[0016]图2为PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白菌株生长曲线图；[0017]图3为PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白表达图；[0018]图4为PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白纯化图；
[0019]图5为PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白促细胞迁移图；[0020]图6为融合蛋白穿膜免疫荧光检测结果图，其中PE为带有KGF2抗体染色，蓝色为DAPI染核。
具体实施方式
[0021]本发明提供了一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白，所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：KETWWETWWTEWSQPKKKKKVGGGGSLGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS。
[0022]在本发明中，所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白中的PEP‑1氨基酸序列为KETWWETWWTEWSQPKKKKKV(SEQ ID No.12)，具有辅助穿膜作用；所述G4S氨基酸序列为GGGGS，其作用是连接作用；所述KGF2氨基酸的序列为(SEQ ID No.13)LGQDMVSPEATNSSSSSFSSPSSAGRHVRSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS，对上皮组织损伤具有修复作用。
[0023]本发明还提供了一种编码上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
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CN 112625140 A[0024]
说 明 书
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在本发明中，编码PEP‑1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
[0025]aag gag acc tgg tgg gag acc tgg tgg acc gag tgg agc cag ccc aag aag aag aag aag gtg。[0026]在本发明中，编码G4S氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：[0027]ggc ggc ggc ggc agc。[0028]在本发明中，编码KGF2氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
[0029]
本发明对所述PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白和编码PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的基因的获取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法常规获取得到即可或委托合成即可。
[0031]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备提高穿透细胞膜能力的药物中的应用。在本发明中，所述药物中优选以PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白为唯一活性物质。本发明对药物的剂型没有特殊限定，采用PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在医学上可接受的剂型即可。
[0032]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复上皮
在本发明中，所述药物中优选以PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白为唯组织损伤的药物中的应用。
一活性物质。本发明对药物的剂型没有特殊限定，采用PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在医学上可接受的剂型即可。
[0033]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞增殖的药物中的应用。在本发明中，所述药物中优选以PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白为唯一活性物质。本发明对药物的剂型没有特殊限定，采用PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在医学上可接受的剂型即可。在本发明中，所述细胞优选包括上皮细胞。
[0034]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备促进细胞迁移的药物中的应用。在本发明中，所述药物中优选以PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白为唯一活性物质。本发明对药物的剂型没有特殊限定，采用PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在医学上可接受的剂型即可。在本发明中，所述细胞优选包括上皮细胞。
[0035]本发明还提供了上述技术方案所述的PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在制备修复急慢性炎症、溃疡和物理化学烧伤的药物中的应用。在本发明中，所述药物中优选以PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白为唯一活性物质。本发明对药物的剂型没有特殊限定，采用PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白在医学上可接受的剂型即可。
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[0030]
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说 明 书
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为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明进行详细地描述，但不能将它们
理解为对本发明保护范围的限定。[0037]实施例1
[0038]PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白序列设计过程：[0039]设计引物：
[0040]P1(上游引物)(SEQ ID No.6)：5’‑atgga tcc aaa gaa acc tgg tgg gaa acc tgg tgg ac‑3’；[0041]P1’(下游引物)(SEQ ID No.7)：5’‑cgc cac cca ctt tac gtt ttt ttt tcg gct gag acc att cgg tcc acc agg ttt ccc ac‑3’；[0042]连接引物L(SEQ ID No.8)：5’‑act acc gcc gcc acc tga gcc acc acc gcc act gcc acc gcc acc cat gtc cag gcc cag‑3’；[0043]KGF2扩增上游引物(SEQ ID No.9)：5’‑ctg ggc cag gac atg gtg ag‑3’；[0044]KGF2扩增下游引物(SEQ ID No.10)：5’‑aaa gtc gac tca gct gtg gac‑3’。[0045]将在genebank检索到的ID号为2255核酸序列(SEQ ID No.11)具体如下，在该序列的基础上合成了SEQ ID No.5：
[0046]atgtggaaatggatactgacacattgtgcctcagcctttccccacctgcccggctgctgctgctgctgctttttgttgctgttcttggtgtcttccgtccctgtcacctgccaagcccttggtcaggtcatggtgtcaccagaggccaccaactcttcttcctcctccttctcctctccttccagcgcgggaaggcatgtgcggagctacaatcaccttcaaggagatgtccgctggagaaagctattctctttcaccaagtactttctcaagattgagaagaacgggaaggtcagcgggaccaagaaggagaactgcccgtacagcatcctggagataacatcagtagaaatcggagttgttgccgtcaaagccattaacagcaactattacttagccatgaacaagaaggggaaactctatggctcaaaagaatttaacaatgactgtaagctgaaggagaggatagaggaaaatggatacaatacctatgcatcatttaactggcagcataatgggaggcaaatgtatgtggcattgaatggaaaaggagctccaaggagaggacagaaaacacgaaggaaaaacacctctgctcactttcttccaatggtggtacactca。
[0047]根据大肠杆菌识别密码子的偏向性，改变密码子，但不改变氨基酸序列，同时按照活性功能区，删除一些不必要的5’端氨基酸序列，用人工合成的方法合成新的KGF2序列(SEQ ID No.5)。[0048]P1和P1’扩增得到含有PEP‑1的片段；然后将该片段作为模板1，用引物P1、连接引物将G4S扩增为模板2；将合成的改为大肠杆菌偏爱的密码子序列但不改变氨基酸序列的SEQ ID No.5作为模板，利用引物KGF2上下游引物合成KGF2片段作为模板3，最后，将模板2和模板3为最终模板，利用P1及KGF‑2下游引物合成目的基因片段PEP‑1‑G4S‑KGF2，PEP‑1‑G4S‑KGF2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。[0049]PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白的氨基酸如SEQ ID No.1所示。[0050]实施例2[0051]1、融合蛋白的酶切鉴定过程
[0052]将融合蛋白载体质粒PET28a‑PEP‑1‑G4S‑KGF2用限制性内切酶BamHI和SalI于37℃的条件下酶切12h，酶切完成后将酶切产物取10μl用于琼脂糖凝胶电泳。[0053]融合蛋白序列酶切鉴定见图1，从图1中可以得出该融合蛋白质粒被验证构建成功。
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说 明 书
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2、融合蛋白菌株生长曲线图
[0055]将融合蛋白菌株PET28a‑PEP‑1‑G4S‑KGF2单克隆菌落接种于5ml新鲜KANLB培养液中，于37℃，200r/min，摇床培养72小时，并分别于0h、24h、48h、72h测定OD600值。结果见图2，从图2中可以看出在此72h内该融合蛋白菌株生长情况良好。[0056]3、融合蛋白制备表达、纯化[0057]融合蛋白质粒构建：将载体PET28a与PEP‑1‑G4S‑KGF2的PCR产物用相同的限制性内切酶BamH I和Sal I于37℃的条件下酶切12h，反应体系如表1：[0058]表1反应体系
[0059]
37℃酶切之后琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切产物。
[0061]DNA回收纯化试剂盒回收目的DNA片段，其操作步骤如下：[0062](1)将含有目的DNA片段的凝胶块切下转入离心管中。[0063](2)按照试剂盒说明书进行操作(具体见博迈德琼脂糖回收试剂盒)[0064]连接反应：[0065]连接体系：载体1.5μl、目的基因6μl、T4连接酶5U/μl 1.5μl、buffer 1μl，共10μl。[0066]转化：
[0067]将从‑80℃冻存的DH5a及BL21(de3)感受态菌株放于冰上融化，然后分别加入1μl的连接产物，冰浴30min。42℃热击90s后冰浴2min。加入1ml的LB培养基37℃培养2h后5000转离心1min集菌。吸取900μl上清弃之，留100μlLB吹散菌液。分别涂抹在含有KAN的LB琼脂培养基上培养过夜。
[0068]将构建好并测序成功的重组质粒PET28a‑PEP‑1‑G4S‑KGF2和空载体PET28a按照上面转化的方法转到BL21(de3)中，涂板培养。从抗性平板上各挑取1个单克隆分别接种于5ml
LB培养液中，摇床培养含有KAN的LB液体至OD600为0.5，按1％的接菌量接种于20ml新鲜KAN
3小时，OD600达到0.5～0.7时，加入IPTG(终浓度为1mM)，于37℃，200r/min，继续培养4h。从0～4小时，每2小时取一次样分别为0、2、4小时，各取1ml。48μlPBS重悬菌体，加入12μl5×上样缓冲液混匀，沸水煮沸10min，利用SDS‑PAGE检测蛋白的表达(图3)，从图3中可以得出融合蛋白得到较高的表达。[0069]收集菌种
[0070]培养好的菌株PET28a‑PEP‑1‑G4S‑KGF2种子液以1％的比例接种，培养温度37℃，搅拌速度200rpm，控制pH7.0，待菌体生长至OD600＝0.5时以1mM IPTG浓度开始诱导，5小时后收样，将发酵液离心(5000rpm、15min、4℃)去上清，收集沉淀。[0071]超声破菌：
[0072]以1:30(w/v)比例，用PBS将菌体重悬；然后以700w功率超声破菌，破菌循环次数为10～15min，分别是4s超声，停11s，镜检破菌率需达到99％。破菌全过程冰浴，温度控制在15℃；破菌后离心(12000rpm、15min、4℃)，收集上清。[0073]亲和层析纯化
[0060]
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目的蛋白是与his标签一起融合表达的，因此选用镍柱收集所需要的his融合蛋
白。目的蛋白纯化的步骤如下：[0075](1)样品及PBS缓冲液用0.45um微孔滤膜过滤。[0076](2)Ni装柱，柱体体积为10ml；[0077](3)用缓冲液1平衡5个柱体体积，流速为1ml/min；[0078](4)将破碎液0.45um滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；[0079](5)用缓冲液2洗5个柱体体积，流速为0.5ml/min；[0080](6)用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为1ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS‑PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；用纯水流洗5个柱体体积，再用20％的乙醇流洗3个柱体体积，流速为2ml/min，柱子置于低温环境中保存。
[0081]缓冲液组成：[0082]缓冲液1：
[0083]50mMpH7.4的PBS缓冲液的配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g，加适量水溶解后定容到1000ml。[0084]缓冲液2：
[0085]50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液，配制：0.5MNaH2PO419ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g，加适量水调pH后定容到1000ml。[0086]缓冲液3
[0087]不同咪唑浓度的缓冲液B配制见表2：[0088]表2缓冲液配置
咪唑浓度缓冲液1量(ml)缓冲液2量(ml)10mM98250mM9010100mM8020200mM6040300mM4060400mM2080
[0090]融合蛋白进行进一步的分离纯化。[0091]离子交换层析纯化
[0092]强阴离子交换柱具体的操作步骤如下：[0093](1)镍柱纯化后蛋白收集液用超滤管进行超滤浓缩，浓缩的样品备用；[0094](2)配制1mM的PBS缓冲液和1mM的Nacl溶液超声除泡后备用；[0095]收集流穿液。(3)取2ml浓缩后的蛋白混合液加入到离子交换柱中，[0096](4)再用PBS进行清洗并收集漂洗液。[0097](5)接着用不同浓度梯度的Nacl(5％、10％、20％、30％)进行洗脱，同样需要收集各个浓度的洗脱液。[0098](6)将收集的流穿液、漂洗液、洗脱液用SDS‑PAGE检测目的蛋白的分布情况。[0099]融合蛋白表达图见图3和融合蛋白纯化图见图4，从图3中可以得出融合蛋白得到
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[0089]
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说 明 书
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较高的表达；从图4中可以得出可收集到纯度较高的融合蛋白。[0100]实施例3
[0101]融合蛋白促进细胞迁移[0102](1)先在6孔板背后用记号笔，比着直尺均匀得划横线，约每间隔0.5～1cm，横穿过孔。[0103](2)在6孔板中加入约5×105个成纤维细胞，于37℃5％CO2，培养箱中培养过夜。[0104](3)培养24h后，用黄色枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。[0105](4)用DPBS洗细胞3次，去除划下的细胞，实验组和对照组分别加入100μg/mLPEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白、等量体积的生理盐水且含3％FBS的细胞培养基。[0106](5)于37℃5％CO2培养箱，培养。分别于0，24小时取样，于显微镜下观察并拍照，结果见图5。
[0107]从图5中可以得出，该融合蛋白促进了成纤维细胞的迁移。[0108]实施例4
[0109]融合蛋白穿膜[0110]细胞培养：
[0111]将购买的人皮肤成纤维细胞株培养于DMEM(含有10％胎牛血清、1％双抗混合液)培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，细胞生长至80％以上，用PBS冲洗2～3次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶常温消化30～60s，轻拍瓶壁使细胞脱落，加入2倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，用枪管吹打均匀，以1000r/min离心8min，去上清，沉淀加入适量完全培养基制成单细胞悬液，调整浓度，将所得状况良好的对数生长期的细胞用于实验。取对数生长期的人皮肤成纤维细胞以1×105个/mL接种于24孔培养板培养，每孔接种900μl，置于细胞培养箱内于37℃、5％CO2培养，24h后取出设立融合蛋白PEP‑1‑G4S‑KGF2实验组和KGF2对照组。实验组分别加入融合蛋白PEP‑1‑G4S‑KGF2 100μl/孔，使其终浓度为100μg/mL，对照组每孔加入100μg/mL的KGF2蛋白(SEQ ID No.5编码)。每组设3个复孔，振荡均匀后将其置于标准培养箱内继续培养24h。[0112]免疫荧光染色[0113](1)弃去培养基，1×PBS洗涤3次，每次3～5min。[0114](2)弃去PBS，用4％多聚甲醛固定15～20min。[0115](3)1×PBS洗2次，每次3～5min。[0116](4)用0.1％PBST透化处理细胞10min。[0117](5)1×PBS洗2次，每次3～5min。[0118](6)加5％BSA(用1×PBS溶解，60℃处理10min)室温封闭30min。[0119](7)吸干，准备KGF2抗体(购于Abcam的抗FGF10)1:50稀释于封闭液中，100μl/孔，室温孵育1h。[0120](8)吸掉一抗，1×PBS洗3次，每次5min。[0121](9)用5％BSA封闭液室温封闭30min。[0122](10)吸掉封闭液，1×PBS洗3次，每次5min。[0123](11)加1:500稀释于1×PBS的PE羊抗兔的二抗100μl/孔，室温避光孵育1h。
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(12)吸出二抗，1×PBS洗涤3次，每次10min。
[0125](13)DAPI(5ng/ml)染核100μl/孔，室温孵育2min。[0126](14)1×PBS洗3次，每次5min。[0127](15)蒸馏水漂洗一次。[0128](16)荧光显微镜下阅片、拍照，结果见图6。[0129]从图6中可以得出，融合蛋白PEP‑1‑G4S‑KGF2与KGF2相比较具有明显的穿膜效果。[0130]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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序 列 表
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序列表<110> 北京致力生科科技有限公司<120> 一种PEP‑1‑G4S‑KGF2融合蛋白及其编码基因和应用<160> 13<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 195<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1
Pro LysLys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln
1 5 10 15
Asp Met ValLys Lys Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gln
20 25 30Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser 35 40 45Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val 50 55 60Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu65 70 75 80Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser 85 90 95Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala 100 105 110Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr 115 120 125Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu 130 135 140Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly145 150 155 160Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly 165 170 175Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val 180 185 190Val His Ser 195<210> 2<211> 588
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CN 112625140 A
序 列 表
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<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2aaggagacct ggtgggagac ctggtggacc gagtggagcc agcccaagaa gaagaagaag 60gtgggcggcg gcggcagcct gggccaggac atggtgagcc cagaggccac caacagcagc 120tcctcctcct tctccagccc ttccagcgcg ggcaggcacg tgcggagcta caaccacctg 180cagggcgatg tccgctggcg caagctgttc agcttcacca agtactttct caagatcgag 240aagaacggga aggtcagcgg gaccaagaag gagaactgcc cgtacagcat cctggagatc 300acaagcgtgg agatcggcgt ggtggccgtc aaggccatca acagcaacta ctacctggcc 360atgaacaaga aggggaagct ctacggcagc aaggagttta acaacgactg taagctgaag 420
aggagaacgg ctacaacacc tacgccagct ttaactggca gcacaacggg 480gagaggatcg
aggcagatgt acgtggccct gaacggcaag ggcgctccaa ggcgcggcca gaagacacgc 540
ccagcgctca ctttctgcca atggtggtcc acagctga 588aggaagaaca
<210> 3<211> 63<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3aaggagacct ggtgggagac ctggtggacc gagtggagcc agcccaagaa gaagaagaag 60gtg 63<210> 4<211> 15<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4ggcggcggcg gcagc 15<210> 5<211> 510<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5ctgggccagg acatggtgag cccagaggcc accaacagca gctcctcctc cttctccagc 60ccttccagcg cgggcaggca cgtgcggagc tacaaccacc tgcagggcga tgtccgctgg 120cgcaagctgt tcagcttcac caagtacttt ctcaagatcg agaagaacgg gaaggtcagc 180gggaccaaga aggagaactg cccgtacagc atcctggaga tcacaagcgt ggagatcggc 240gtggtggccg tcaaggccat caacagcaac tactacctgg ccatgaacaa gaaggggaag 300ctctacggca gcaaggagtt taacaacgac tgtaagctga aggagaggat cgaggagaac 360ggctacaaca cctacgccag ctttaactgg cagcacaacg ggaggcagat gtacgtggcc 420ctgaacggca agggcgctcc aaggcgcggc cagaagacac gcaggaagaa caccagcgct 480
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cactttctgc caatggtggt ccacagctga 510<210> 6<211> 37<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6atggatccaa agaaacctgg tgggaaacct ggtggac 37<210> 7<211> 59<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7
tttacgtttt tttttcggct gagaccattc ggtccaccag gtttcccac 59cgccacccac
<210> 8<211> 60<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8actaccgccg ccacctgagc caccaccgcc actgccaccg ccacccatgt ccaggcccag 60<210> 9<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9ctgggccagg acatggtgag 20<210> 10<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10aaagtcgact cagctgtgga c 21<210> 11<211> 624<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11atgtggaaat ggatactgac acattgtgcc tcagcctttc cccacctgcc cggctgctgc 60tgctgctgct ttttgttgct gttcttggtg tcttccgtcc ctgtcacctg ccaagccctt 120ggtcaggtca tggtgtcacc agaggccacc aactcttctt cctcctcctt ctcctctcct 180
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tccagcgcgg gaaggcatgt gcggagctac aatcaccttc aaggagatgt ccgctggaga 240aagctattct ctttcaccaa gtactttctc aagattgaga agaacgggaa ggtcagcggg 300accaagaagg agaactgccc gtacagcatc ctggagataa catcagtaga aatcggagtt 360gttgccgtca aagccattaa cagcaactat tacttagcca tgaacaagaa ggggaaactc 420tatggctcaa aagaatttaa caatgactgt aagctgaagg agaggataga ggaaaatgga 480tacaatacct atgcatcatt taactggcag cataatggga ggcaaatgta tgtggcattg 540aatggaaaag gagctccaag gagaggacag aaaacacgaa ggaaaaacac ctctgctcac 600tttcttccaa tggtggtaca ctca 624<210> 12<211> 21<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)
12<400>Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys1 5 10 15Lys Lys Lys Lys Val 20<210> 13<211> 169<212> PRT<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser Tyr Asn 20 25 30His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys 35 40 45Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys 50 55 60Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly65 70 75 80Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn 85 90 95Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys 100 105 110Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe 115 120 125Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys
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130 135 140Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala145 150 155 160His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser 165
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