脂肪酶活力测定方法及其比较

雷启义;邹凯;周江菊;张文华

【摘 要】目前脂肪酶活性测定方法主要有平板法、滴定法和比色法,其中比色法又包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法.本文对上述方法的精确度,所需实验仪器、试剂及费用,操作方法的难易程度进行系统的比较,并得出各种方法的优缺点及应用范畴.

【期刊名称】《凯里学院学报》 【年(卷),期】2011(029)006 【总页数】3页(P43-45)

【关键词】脂肪酶活力测定;平板法;滴定法;比色法;铜皂法;微乳液发;对硝基苯酚法 【作 者】雷启义;邹凯;周江菊;张文华

【作者单位】凯里学院环境与生命科学学院,贵州凯里 556011;铜陵外国语学校,安徽铜陵363100;凯里学院环境与生命科学学院,贵州凯里 556011;凯里学院环境与生命科学学院,贵州凯里 556011 【正文语种】中 文

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）是一大类催化长链酯键水解和形成的酶类，具有对油－水界面的亲和力，能在油－水界面以高催化速率水解不溶于水的长链酯类化合物，该反应只作用于异相系统，即在油（或脂）水界面上作用，而对均匀分散的或水溶性底物无作用［1－3］.脂肪酶在动植物的各种组织及许多微生物中普遍存在，尤其在微生物界分布广泛，目前已发现假单孢菌、曲酶、青霉、链霉菌等多种微生

物可产脂肪酶［4－6］.近年来随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油水界面上进行水解反应的范围，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成、生物能源的生产等方面，是继蛋白酶，淀粉酶之后上第三大工业用酶［7－10］.脂肪酶活性的检测一般根据目的不同选择合适的底物和方法.本文对目前脂肪酶活性检测方法进行了概括，并在此基础上对各种方法的使用仪器、操作难易、试剂成本、结果精确度、应用范畴进行了分析和总结.

平板法测定脂肪酶的活性主要是依据脂肪酶将琼脂平板中的底物（如三丁酸甘油脂）催化生成的游离脂肪酸与琼脂中的指示剂（罗丹明B或维多利亚蓝）反应，在琼脂平板中形成比较清晰的水解圈.由于水解圈有效直径的大小与酶活对数呈线性关系，因此可根据水解圈直径对酶活进行定性和定量分析.酶的活力单位（U）定义为在测定条件下每分钟水解产生1μmol游离脂肪酸所用的脂肪酶量［11－12］. 滴定法首先需要将橄榄油与聚乙烯醇溶液在高速组织搅拌机（或超声破碎仪）的搅拌下配制成乳化液，随后利用脂肪酶将乳化的橄榄油水解成脂肪酸和甘油，再使用标准碱溶液结合指示剂对产物脂肪酸进行酸碱滴定（或直接用pH酸度计代替指示剂），由耗碱量求出脂肪酶的活性.酶的活力单位定义同平板法；其计算公式为：脂肪酶活力＝（V－V0）／t×m×n.式中，V 样品消耗碱的体积，V0空白消耗碱的体积，t反应的时间，m指1mL碱中所含的氢氧根的微摩尔数，n酶液稀释倍数.在该法中乳化液的分散程度是影响测定结果的一个关键性因素［2，13］. 比色法又称分光光度法或光谱检测法.铜皂法主要是利用脂肪酶将橄榄油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和显色剂（5%的醋酸酮溶液用吡啶调至pH＝6.1）中的铜离子反应生成铜皂蓝色铬合物在710nm波长下有最大吸收值，再对照脂肪酸吸光度工作曲线得出脂肪酸的浓度，计算出酶的活性.酶的活力单位同平板法，其计算公式为：脂肪酶活力＝CV／TV1.式中，C脂肪酸

的浓度，V脂肪酸／苯溶液的体积，T作用时间，V1酶液的用量.这样方法操作相对复杂，同时由于金属离子的干扰，也会影响检测的准确性［14－15］. 该种方法是在传统滴定法和铜皂法基础上改进的一种方法［16－17］.微乳液是由水、表面活性剂和非极性溶剂在适当配比条件下自发形成的热力学稳定、光学透明、宏观均一的单分散体系.黄锡荣等利用琥珀酸二辛酯磺酸钠为表面活性剂，异辛烷为有机溶剂形成了微乳液［16］，张海燕等改进了这一方法，利用价格较便宜的吐温－80和正己烷来形成微乳液环境［17］.在微乳液环境下，脂肪酶水解三油酸甘油酯生成的脂肪酸与铜离子形成铜皂，经苯萃取后进行比色测定.酶的活力单位定义同平板法.酶活计算同铜皂法.

对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在420nm波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力.这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［2，18］.酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力＝VN（C（样）－C（空白））／T／V（稀释酶液）.式中，V反应总体积，N稀释倍数，C根据吸光度A求出的对硝基苯酚的浓度，t反应时间，V（稀释酶液）稀释酶液的体积.

平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器，培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单［2，13］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［13］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法.铜皂法使用的主要仪器是分光光度计，超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［15］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单，精确度高［16－17］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计，操作简单［2，18］（表1）.

平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明B等，该实验反应

时间长且精确度差［11］.滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［13］.滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［11，19］.铜皂法中的底物有3种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［15］.其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性，精确度较高.微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温－80和正己烷，实验重复性好，精确度高［16－17］.对硝基苯酚法使用的试剂主要是对硝基苯酚，稳定性好且非常精确［2，18］（表1）.

平板法所使用的仪器十分常见、所使用的试剂也比较便宜，但该种方法的误差较大同时需要的时间很长，因此该种方法主要应用于产脂肪酶菌种的筛选及批量酶样品的快速测定［11］；滴定法所使用的仪器常见、操作简单，所使用的试剂比较便宜，精确度较高，适合于学生实验和具备简单仪器的实验室测定脂肪酶的活性［2］；铜皂法所使用的仪器较常见、操作繁琐、稳定性不高，但实验精确度高且试剂较便宜，大部分实验室和生物技术公司用该种方法测定脂肪酶的活性［15］；微乳液法所使用的仪器常见、操作简单，重复性好，但试剂价格偏高，主要适用于实验室和生物技术公司对酶活性的精确测定［16－17］；对硝基苯酚法所使用的仪器常见，但试剂对硝基苯酚价格昂贵且有毒，主要适用于实验室对酶活性的精确测定［2，18］（表1）.

在脂肪酶活性检测时，可根据实验目的、实验设施及节约成本的原则选择适宜的方法和底物来检测脂肪酶活性.在活性检测过程中，酶活力单位的计算尽量在最适温度、最适pH、酶浓度以及适宜的底物浓度下进行，从而使测定的脂肪酶活性达到最大值，使结果更加准确和可信.另外，由于酶的活力单位可以根据计算和记录的方便而自行定义，给交流和工业生产造成麻烦，建议在测定脂肪酶的活力时，尽量使用国际单位来计算酶活.

致谢 本文受到贵州省教育厅重点扶持学科基金和凯里学院植物学重点学科基金资助.

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