食 陛致病菌样品检测处理技术研究进展 随着经济全球化进程的加快 食品安全已成为当今世界 性公共卫生热点，而食源性致病菌是食源性疾病中最常见的 生物致病因素．感染后可引起细菌性食物中毒和多种感染性 腹泻。随着科学技术的发展，针对致病菌的检测技术多种多 样 灵敏度．特异性及检测速度都得到了极大改善。但基于核 酸扩增的技术很难避免样本中存在的死亡菌体对检测结果的 影响而造成的假阳性结果，很多传统增菌培养方法低估了由 温度、盐类、干燥 辐射、重金属、抗生素、高压等多种因素造 成的微生物受损，这些受损微生物在合适的条件下可以恢复 到正常状况 是影响食品安全的一种潜在威胁。另外，目前的 热点技术，如基因芯片技术、生物传感器技术等虽然使用方 便，但依旧很难避免样品处理过程对检测的影响。本文将对 食源性致病菌相关样品前处理技术的研究进展进行综述，以 便开发出快速灵敏、使用方便、价格低廉的检测技术。 １．膜浓缩技术 利用膜浓缩技术或免疫磁珠等浓缩技术选择性去除样本 基质中影响致病菌检测的物质，同时浓缩样本中致病菌的浓 度，从而达到间接增高检测灵敏度的目的。Ｃｈｅｎ，Ｗ Ｔ等２００５ 年利用膜过滤技术研究了膜结构、孔尺寸及吐ｆＡ２ｏ等对单增 李斯特茵的分离浓缩效果。回收过程中添加吐温２０可以防止 菌被膜不可逆吸附以保证高回收率，另外通过比较聚碳酸 酯、混合纤维素、尼龙及ＰＶＤＦ等不同材质的膜及０ ２－－０ ４５ ４１ ｍ 大小不同的滤膜孔径，发现０ ２ ｍ的聚碳酸酯 单向直孑Ｌ可 获得较高的回收率。该课题组利用注射过滤器可将５ＯｍＬ食品 样本浓缩至５００ Ｌ，菌的回收率为９５％．这种方法比较适合于 ４８食品安全导 １ ２０１ ２年８月刊 口侯东军王海姜艳彬中国动物疫病预防控制中心 液体量较大的样品中病菌的浓缩。Ｆ Ｊｔｚｍａｕ ｒｉｃｅ．Ｊ等结合多重 ＰＣＲ检测比较了膜技术和免疫磁珠分离技术对大肠杆菌在牛 肉中的回收效果。研究表ｑ３７℃下 增菌时ｉ６＞１６ｈ Ｆｌ￣ 菌量高 Ｔ－ｌｏｇ（１０）９ ６～７ ５ｅｆｕ／ｍＬ￣７，，膜分离和免疫磁珠分离均可回收 到相同程度的茵．｛ＩＪ￣ＰＣＲ技术都可检测到。若大肠杆菌量降 ￣ｌｏｇ（１０）６ ４ｃｆｕ／ｍＬ，只有免疫磁珠分离的菌量可以用ＰｃＲ检 测到，低于这个水平后，两种菌分离方法分离的菌都不能通过 ＰＣＲ检测到 ２．离心浓缩技术 Ｋ Ａ Ｓｔｅｖｅｎｓ等采用离心分离牛奶中的单增李斯特菌和肠 道沙门氏茵，结合ＰＣＲ￣．行检测。Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｈ等利用浮力密 度梯度离心（Ｂｕｏｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）从复杂 的食品基质中分离细菌，除去一些不利于快速检测方法反应 如ＰＣＲ反应的物质 避免死细胞中来源ＤＮＡ带来的假阳性结 果。结合过滤，低速 高速离心，浮选和浮力密度梯度离心，在 １３种不同类的食品中１２种致病菌可以被快速分离（沙门氏茵、 大肠杆菌、结肠炎耶耳森菌、空肠弯曲杆菌、霍乱弧菌ｏ１ ３ｇ、 副溶血弧菌、创伤弧菌、产碱普罗威登斯茵、嗜水气单胞茵 蜡 状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌）。这种方法可 以结合实时荧光定量ＰｃＲ和活细胞计数进行检测。这些技术 相结合 理论上，食品中的这些目标微生物可被浓缩￣２５０倍． 检测限可低至１Ｏ１～０３ＣＦＵ／ｇ。分离 浓缩技术和实时荧光定 量ＰＣＲ＃￣合在３ｈｌＸ］就可检测出１０１－１０２ＣＦＵ／ｇ自然感染的鸡 肉中的沙门氏茵和空肠弯曲杆菌，以及食源性中毒食物中的 金黄色葡萄球菌，结果表明使用这些方法是可行的。 ３．直接吸附浓缩技术 沸石可以在表面吸收微生物，并且对某种沸石可以选择 性的吸收特异的微生物。Ｋｕｂｏｔａ．Ｍ等使用不同的微生物细胞 系测试了在不同的ｐＨ值下沸石的吸收能力。发现某些微生物 细胞系的吸收取决于ｐＨ 还有些微生物喜欢酸性ｐＨ。电位势ｚ （ｚｅｆａ—ｐ。ｔｅｎｔ旧ｓ）被用于计算沸石和微生物细胞之间的双电 荷层互作用能。发现在互作用能和实验吸附结果之间存在关 系。他们还使用微生物吸附碳氢化合物法（ＭＡＴＨ）评价了细菌 细胞表面的疏水性并进行了相对定量，结果发现了吸附结果 细菌细胞的疏水作用和沸石之间存在一定的关系。这些结果 表明沸石对细菌的吸附主要可以用双电荷层相互作用和疏水 相互作用来解释。最后 利用沸石Ｎａ—ＢＥＡ￣Ｉ３Ｈ—Ｙ．成功地分离 了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，表明沸石可 以很有效地被用于快速、方便、准确地分离细胞。Ｋｕｎ Ｙａｎｇ等 研究发现平均５００ｎｍ的超顺磁阴离子交换材料磁珠（ＳｉＭＡＧ ｂｅａｄｓ）可用于吸附浓缩非常稀释的液体中的病原菌。实验证 明当溶液／磁珠的体积比为１ｏｏｏ￣ｔ，可从１０４ＣＦＵ／ｍＬ显著减低 检坝 限至１ ０２ＣＦｕ／ｍＬ。 ４．免疫磁分离技术 免疫磁分离技术（１ｍｍｕｎ。ｍａｇｎｅｔＩｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）是利用一种 表面包被有针对目标菌的特异ｌ＿生抗体的超顺磁材料从样本中复 杂的基质中选择性分离目标菌的分离技术。Ｘｉａｏ—Ｌｉ Ｓｕ等用量 子点（ＱＤｓ）作为荧光标记在免疫磁珠上用于选择性分离大肠 杆菌Ｏ ：Ｈ ，分离后再将磁珠与结合有生物素的大肠 杆菌Ｏ ：Ｈ ，抗体结合形成夹心复合物，将复合物用 荧光测量装置进行检测，最终检测限可１氐至］Ｏ３ＣＦＵ／ ｍＬ。Ｚｈｅｎｇ－Ｙｏｕ Ｙａｎｇ等用免疫磁珠分离技术分离肉 中的产气荚膜杆菌．结合ＰＣＲ扩增可在１０ｈ内检测肉 中最低１ＯＣＦＵ／ｇ的产气荚膜杆菌，同传统的培养方法 进行比对后，结果一致。Ｓａｍｕｅｌ Ｄｕｏｄｕ等结合过滤技 术可在３ ５ｈ内快速检测鲑鱼中的单增李斯特菌 Ｌｅ Ｌｙ Ｔｈｕｙ ｌ１ｒａｍ等在３ｈ内利用ＩＭＳ—ＰＣＲ技术可最低检 测鸡肉中１ＯＣＦＵ／￣Ｌ的空肠弯曲杆菌。 ５．增菌培养基的改良 目前，针对培养基的研究主要表现在比较不同 培养基的增茵效果 从而达到用于减少增菌时间的目的，一般 不同的致病菌需要的培养基会不同。Ｚｈａｏ，Ｔ等研究讨论了一 种普遍适用的培养基（ＵＰＢ）恢复受损伤的病菌或增菌．以便 于在尽量短的时间下更有效的进入检验阶段，比较了不同增 菌时间下对后续免疫学快速检测或ＰＣＲ快速检测等快速检测 方法的影响 研究发现在ＵＰＢ培养基中，对于免疫检测或ＰＣＲ 检测，增菌６ｈ不足于达到能检测的菌量，受损细菌一般在生长 之前需要３－４ｈ的恢复。 ６．展望 各种致病菌检测的前处理技术各有所长 也有各自的缺 陷，很难指望一种技术解决所用问题。为了提高灵敏度和特异 性．缩短检测时间，研究人员通常要把一些技术结合起来，扬 长补短．比如可通过优化增茵培养基成分缩短增菌时间后， 结合离心、超滤等浓缩纯化技术去除影响后续检测反应的物 质 浓缩靶标菌来达到快速、灵敏、特异的检测目的。将快速 有效的前处理技术开发成功后，目前基于不同检测原理的致 病菌检测技术将得到更加广泛和有效的应用，￣ＥＩＧ ｒａｎｔ， ＩＲ等 将ｌＭｓ和ＰＣＲ技术相结合开发出免疫磁分离ＰＣＲ快速检测技 术，（ＩＭＳ－ＰＯＲ）检测牛奶样品中的分支杆菌和类结核菌 并利 用离心技术将牛奶样品从１ ＯｍＬ或５０ｍＬ浓缩至１ ｍＬ 然后进行 免疫磁珠分离，大大提高了检测灵敏度和特异性。 襄 Ａｕｇ ２。１ ２ ＦＯＯＤ ＳＡＦＥＴＹ ４９