分子生物学技术在猪流感诊断中的应用

分子生物学技术在猪流感诊断中的应用

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谢金文1，，苗立中2，沈志强1，

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600)摘

要：猪流感是由正粘病毒科猪流感病毒引起的猪的一种急性、热性和高度接触性、群发性呼吸道疾

病，其临床上以发病急促、高热咳嗽、鼻中流出分泌物、呼吸困难、衰竭，怀孕母猪繁殖障碍、流产、死亡等病症为特征。目前，猪流感在我国各地广泛存在和发生，给养猪业带来了巨大的经济损失，并且严重危害人类的健以期为猪流感的及时诊断提供参考。康。文章就猪流感分子生物学诊断技术进行简要概述，

关键词：猪流感；分子生物学；诊断中图分类号：S851.3

文献标识码：A

ApplicationofMolecularBiologyinDiagnosisofSwineInfluenza

XIEJin-wen

1,2

,MIAOLi-zhong2,SHENZhi-qiang1,2

(1.ShandongBinzhouAnimalScience＆VeterinaryMedicineInstitute,Binzhou256600;

2.ShandongLvduBio-Sciences&TechnologyCo,Ltd.Binzhou256600,China)

Abstract:Swineinfluenza,causedbyOrthomyxoviridaeDivisionswineinfluenzaviruses,isanacute,feverandahighdegreeofcontact,andrepeatedrespiratorydisease.Theclinicalexhibitioncharacterizedtherapidonset,highfevercough,nasaldischargefromthebreathingdifficulties,failure,andpregnantswinereproductivefailure,abortion,deathandsoon.Atpresent,theswineinfluenzawidespreadoccurredinChinaandaroundandbroughthugeeconomiclossesandseriousharmtohumanhealth.Itisbriefoverviewontheswineinfluenzadiagnostictechniquesofmolecularbiologyinthepaper,toprovidethereferenceoftimelydiagnosisofswineinfluenza.

Keywords:Swineinfluenza;Molecularbiology;Diagnosis

猪流行性感冒，简称猪流感(Swineinfluenza,SI)，由猪流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、热性和高度接触性、群发性呼吸道疾病，其临床上以发病急促、高热咳嗽、鼻中流出分泌物、呼吸困难、衰竭，怀孕母猪繁殖障碍、流产、死亡等病症为特征。

目前已经发现流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)有16个亚型，神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)有9个亚型，而发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H2N3、H3N1、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2共10种不同的血清亚型[1-2]。但目前造成世界性流行的SIV血清型只有H1N1、

收稿日期：2009-12-11；修回日期：2010-01-06

作者简介：谢金文（1981-），男，助理研究员，硕士，主要从事分子生

物学与兽医免疫学方面的研究。H1N2和H3N2。同时也有其它血清型的零星报道，如英国的H1N7、美国的H4N6、中国的H9N2和H5N1等，但都没有造成大规模的流行[3]。

该病一年四季都可发生，但多发生于冬季、早春等天气骤变季节，各种年龄、品种和性别的猪均能感染。单纯的SIV感染能引起猪的高发病率(几乎100%)和低死亡率(病死率≤1%)，病猪一般能够迅速康复，此病的发生只使患病猪生产性能下降，推迟上市。其严重程度与流行毒株、猪只日龄和健康状况、环境条件以及与其他病原体并发继发感染相关，常因与其他病原体混合感染，使死亡率明显增高[4]。由于SIV是猪呼吸道疾病综合征(Porcinerespira－torydiseasecomplex,PRDC)的主要病原体之一，感

染后常发生肺炎，还可引起怀孕母猪繁殖障碍。SIV可损害呼吸道上皮细胞，容易继发和并发传染性胸3期谢金文等：分子生物学技术在猪流感诊断中的应用31膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoni－

ae,APP)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerepro－ductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)、巴氏杆菌和弓形虫感染等，使疫病更为复杂，死亡率增加，给养猪业带来了极大的危害。

本病主要是猪与猪之间经空气传播，或因猪群中转入带毒猪只而传播。另外，猪的种间屏障相对较低，猪可被禽流感病毒和人流感病毒感染，因此，猪被认为是人、禽和(或)猪流感病毒通过基因重排产生新的亚型流感病毒的“混合器”或活载体，在流感病毒传播链中起到中间宿主的作用，因此猪流感已成为世界医学界共同关注的焦点。SIV不仅可感染猪，同时也具有感染人、禽、马、鸟类和其他哺乳动物的能力。因此，猪流感的影响不仅在于其显而易见的兽医传染病学的意义，更在于其深远的公共卫生意义[3]。

自美国1918年首次报道本病以来，欧、美、亚、非、澳等世界各大洲均有本病的发生和流行，是一种世界性的猪呼吸道传染病，但主要以地方流行为主，已成为规模化猪场的常发传染病。近年来，我国不少省市地区调查表明，我国猪群中普遍

SI抗体阳性率受H1亚型和H3亚型SIV感染，

呈上升趋势。因此，本文综合阐述了猪流感的分子生物学诊断技术的研究，为及早及时确诊猪流感提供技术参考。

水平[5-6]。吕翠等[7]根据猪流感病毒的M基因的序列，设计合成了1对引物，建立了检测猪流感的RT-PCR方法。应用该方法对Hl、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增，均获得了分子量为460bp的特异性目的片段，而对PRRSV、猪圆环病毒Ⅱ型(Porcinecircovirus2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、猪瘟病毒(Clas－sicalswinefevervirus,CSFV)进行同条件检测，结果均为阴性；SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99％～100％。敏感性试验表明，该方法可检测到103EID50的SIV；可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。Fouchier等[8]用相当于4μL尿囊液中的RNA进行PCR扩增，对于检测的每株A型流感病毒，均扩增了244bp片段；用相当于0.2TCID50流感病毒的RNA进行PCR扩增，可见244bp预计大小的DNA片段，表明该法快速、敏感、特异，适于目前所知所有A型流感病毒变异株。

2RT-PCR-ELISA技术

1常规聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)是一种人工体外DNA扩增技术，最早是由Mallis等于1985年建立的，并于1987年完成了自动化操作，极大地推动了分子生物学的发展，同时也为病毒性疾病的诊断提供了一个崭新的手段。在临床病料检测中，要经常检测RNA病毒，而通常所用的PCR试剂盒中的是DNA聚合酶，不能以RNA为模板直接扩增，故在进行PCR前

因此建立了RT-先将病毒RNA反转录为cDNA，

PCR技术。随着猪流感病毒分子生物学研究的深入，一些基于不同靶基因的RT-PCR检测方法在国内外相继建立。RT-PCR作为检测病毒的一种

灵敏度高、重复性好、操作也不复方法，特异性强、

杂、整个过程在一天内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，可用于临床。目前，在许多实验室里已广泛应用PCR方法来检测猪流感病毒，且检测的敏感度达到了pg

RT-PCR-ELISA诊断技术是将RT-PCR方法

和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，用地高辛标记猪流感病毒的RT-PCR产物，再建立猪流感的PCR-ELISA方法。用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物，最后进行免疫显色得出结果。该方法的敏感性

克服了比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上，

组织样品中猪流感含量少而难以检测的困难，为猪流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新

Munch等[9]建立了RT-PCR-ELISA方法，该途径[6]。

并可用于隐性感染的方法比RT-PCR敏感100倍，

检出。但该方法对SIV的检测国内未见报道。

3套式RT-PCR技术

套式RT-PCR技术是一种先后用两套引物(外引物和内引物)对反转录产生的cDNA进行扩增的PCR技术，将外引物扩增片段又经内引物扩增，这样既可增加反应的特异性，又可获得高丰度特异靶序列，增加了敏感性。将RT-PCR技术与石蜡切片结合，检测石蜡包埋组织中RNA进行基因分析已成为一个热点，该技术已被广泛应用于

祁贤临床，特别是病毒感染性疾病的基因诊断[10]。

等[11]针对SIV保守基因NP(核蛋白Nucleocapsidprotein，NP)建立了套式RT-PCR法，其敏感性与RT-PCR-ELISA法相同，但比后者易于操作。35

32吉林农业科学35卷份临床样品套式PCR阳性率为28/35，鸡胚病毒分离方法阳性率23/35，两者符合率为82%，且比后者敏感。部分临床样品采自无明显流感症状的猪体，经套式RT-PCR和病毒分离都为阳性，表明该法也适用于SIV隐性感染的检出。

4多重RT-PCR技术

多重PCR，又名复合PCR，是一种特殊的PCR形式，是在单一PCR基础上发展起来的新技术，通过寡核苷酸引物组合，在一个PCR反应体系中同时扩增多个靶序列，其扩增的特异性和效

但同时可扩增针对不同模板率与单一PCR相当，

的多个靶序列，能节约时间和精力，在样品的鉴别诊断中是一项简便、快速的方法，尤其适用临床病原分型检测。Choi等[12,13]采用多重RT-PCR方法对SIV和人流感病毒进行了分型研究，但仅限于

H3和N1、N2亚型的鉴定，不能确定对已知H1、

被检样品中是否还有其他亚型的流感病毒。刘惠莉等[14]根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因，H1、H3亚型HA基因，N1、N2亚型NA基因核苷酸序列，经DNAStar软件类比选择保守区设计引物，经对不同亚型模板的扩增、检验，建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感

N1/N2神经氨酸酶亚病毒及H1/H3血凝素亚型、

型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸，核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉拭子等85份，与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较，阴性样品检测符合率达100%。温纳相等[15]为区分H1、H3和N1、N2，以便及时掌握猪流感流行情况，为更准确地选用猪流感疫

灵苗及免疫提供更科学的理论依据，建立了快速、

敏、准确的猪流感双重RT-PCR检测技术。吕晓丽等[16]根据已发表的猪乙脑病毒(Japaneseen-cephalitisvirus,JEV)的E基因序列和猪流感病毒

设计合成了2对特异引物，最终的NP基因序列，

成功地建立了JEV和SIV的复合RT-PCR诊断方法。该方法特异性较好，敏感性较高，对JEV和SIV的最低检出量分别为100和10pg的cDNA。

5实时荧光定量PCR技术

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出。与常规PCR相比，它的特异性更强，有效解决了PCR产物污染的问题，且自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量。由于实时定量荧光PCR技术的种种优点，使得它在动物疫病的诊断中也有广泛的应用。目前，实时定量荧光PCR技术已经被正式写入我国的禽流感检测技术规范，作为一种法定的诊断方法。该技术也逐渐成为猪流感诊断方法研究的方向。由于实时定量荧光PCR仪可以同时检测多种荧光，因此可以进行多重检测，即在同一个反应体系中，将不同探针标记不同的荧光基团，这样就可以同时检测多种疾病的病原，这也是疫病诊断的一个研究方向[17-18]。Landolt等[19]将基于M基因保守部位的实时RT-PCR和两种细胞系(MDCK和MvlLu)分离病毒检测鼻拭子样品进行比较，结果显示它的特异性达100%，敏感性达88%～100%，表明实时RT-PCR在筛选大量鼻拭子样品中的SIV时是一种快速、准确的方法。Richt等[20]建立的实时RT-PCR，能检测H1和H3SIV，敏感性可达每一反应仅需2个M基因特异的负链RNA分子，试验感染猪的肺洗液中仅需0.05TCID50。与病毒分离相比，该RT-PCR的敏感性和特异性分别为94%和85%。张春明等[21]根据猪流感病毒M基因的保守序列，设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针，建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。该方法的敏感性可达到1个EID50，样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100％，该方法特异性强、重复性好，有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。段廷云等[22]根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序

利用Premierexpress设计并合成列(DQ889686)，

1对引物和相应的TaqMan探针，从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA，经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-TEasy载体中，转化大肠杆菌JM109，经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模

引物浓度、镁离子板建立标准曲线。对探针浓度、

浓度和退火温度进行优化，建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。经临床应用表明荧

定量光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、

分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。

6NASBA法

3期谢金文等：分子生物学技术在猪流感诊断中的应用33NASBA即核酸序列依赖的扩增(Nucleicacid

sequencebasedamplification,NASBA)，是一种扩增RNA的新技术，是由一对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，并且不需要任何特殊的仪器。LauLT等[23]将NASBA方法应用于AIV检测，整个试验过程在6h内即可完成，且具有很高的敏感性和特异性。目前，国内还没有应用该方法

由于SIV和AIV同属A型流感检测SIV的报道，

病毒，NASBA在SIV检测上应用前景广阔[5]。

7核酸探针技术

核酸探针技术是以病毒基因组为模板，在分子标记的基础上制备探针，反转录生成cDNA后进行Southernblot。特异的核酸探针会在不同病毒基因组cDNA上产生特异性条带。核酸探针技术有特异性强、准确可靠的优点，但需要合成核酸探针，诊断费用较高[6]。吕翠等[24]以地高辛(DIG)标记猪流感病毒M基因的保守片段制成核酸探针，与H1及H3亚型的SIV的cDNA、PRRSV的cD－NA、PCV2的DNA、CSFV的cDNA、PRV的DNA进行斑点杂交，以检测探针的特异性，结果该探针仅与H1及H3亚型的SIV的cDNA杂交呈阳性，与其余病毒杂交呈阴性；敏感性试验显示，探针最低能检出约5pg的H3亚型的SIVRT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测，结果检出9份阳性，与RT-PCR检测结果一

建立的DIG标记的核酸探针致。研究结果表明，

特异性强，敏感性高，适合于对SI的诊断和流行病学调查。

8基因芯片检测技术

“将整个实验室缩微到一片芯片上”的愿望。实现

基因芯片技术在动物疾病诊断等领域有广泛的应用前景，对于SI的防控也具有一定的意义。LiJ.等[25]建立了用以鉴别流感病毒型和亚型的DNA芯片检测方法，设计的26个引物对可从A型流感病毒的HA(H1、H2、H3)、NA(N1、N2)和NP基因，以及B型流感病毒的HA、NA、NP基因上的目的基因杂交，从而达到鉴别型和亚型的目的，他们认为DNA芯片的方法可以作为PCR方法的一个补充，但这种方法检测临床样品中的核酸序列

陈红军[26]根的有效性还有待于作进一步的研究[5]。

据流感病毒的HA和NA基因序列间的差异性，采用基因芯片技术，借助多重PCR和核酸标记技术，构建了猪流感病毒亚型分型基因芯片，用于猪流感病毒亚型的分型，具有检测A型流感病毒和同步鉴别猪流感病毒H1、H3、H9、N1和N2亚型

并利用制备好的基因芯片检测了从青岛、的功能。

烟台、潍坊、济宁、南昌、葫芦岛等市健康猪群或病死猪采集的鼻拭子或组织426份，检测结果和PCR的符合率在87％以上，鸡胚传代病毒分离检测结果同基因芯片与PCR的检测结果相差比较大。结果表明猪流感病毒分型基因芯片可以作为猪流感病毒监测的一种重要手段，其灵敏度高于PCR方法。

SI是主要的猪免疫抑制病之一，在我国养猪场中普遍存在，难以根除。SIV不仅给畜禽养殖造成了重大经济损失，而且SIV在流感病毒的种间传播中具有重要作用，对人类健康造成了很大的威胁。随着分子生物学的不断发展，基于PCR技术的新的快速诊断方法的相继建立，为快速准确检测SIV提供可靠的技术手段，为最终控制和消灭SI奠定坚实的基础。

参考文献：

基因芯片(GeneChip)通常指DNA芯片，其基本原理是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚

固定高密度的数以万计的焦显微技术，使得合成、

探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。基因芯片技术在分子生物学研究、临床检验、生物制药和环境医学等领域显示出了强大的生命力，其中关键就是基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，从而有可能[1]MaW.,VincentA.L.,GramerM.,etal.Identificationof

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3结论

在含不同Cd、Pb浓度的土壤中种植百日草的盆栽试验中，通过对植株的各项生理生化指标以及植株体内富集重金属含量的测定，试验结果表

①随着土壤中含Cd、Pb浓度的增大，对种子的明：

萌发均会起到抑制作用，同时随着重金属浓度的增加，植株体内的叶绿素含量、丙二醛含量也有明

百显的下降趋势。②在Cd浓度为100mg/kg时，

日草对Cd的富集效果最好；在Pb浓度为1000mg/kg时，植株对Pb的富集效果也较好，此时植