一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109090102 A(43)申请公布日 2018.12.28

(21)申请号 201811033321.6(22)申请日 2018.09.05

(71)申请人 成都汇欣生命科技有限公司

地址 611730 四川省成都市高新区新航路1

号附10号(72)发明人 谭汝福　

(74)专利代理机构 成都天汇致远知识产权代理

事务所(普通合伙) 512

代理人 韩晓银(51)Int.Cl.

A01N 1/02(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图4页

()发明名称

一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法

(57)摘要

本发明公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法。上述的冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％。本发明的冻存液在保证间充质干细胞深低温冻存条件下细胞活性不低于传统现有方法前提下，避免现有通用方法某些成分存在的低毒性和补体反应带来的潜在风险。

CN 109090102 ACN 109090102 A

权　利　要　求　书

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1.一种间充质干细胞通用无血清冻存液，其特征在于，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞通用无血清冻存液，其特征在于，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。

3.一种间充质干细胞通用无血清冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在正常工作的生物安全柜中，按照体积百分比称量以下组分：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％；

步骤2、在正常工作的生物安全柜中，空气净化LED灯变绿，准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；

步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格；

步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。4.一种间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过80-85％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜，消化至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；

步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；

步骤3、离心收集细胞：将离心管配平进行离心，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；

步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；

步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，胰蛋白酶的质量百分含量为0.125％－0.25％，消化时间为1－2min。

6.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，离心转速为1000-1200rpm/min，离心时间为5分钟。

7.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，收集的细胞的终密度1*10^6-2*10^7/ml。

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一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法

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技术领域

[0001]本发明属于再生医学生物技术领域，具体地说，涉及一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法。

背景技术

[0002]间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫和自我复制等特点而日益受到人们的关注。[0003]如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。[0004]将间充质干细胞从不同的人体组织中分离培养出来后，再经过检测鉴定，然后将其冻存于-196℃的深低温中，以便于在临床需要时可以将间充质干细胞复苏用于给病人回输，达到治疗疾病的目的。-196℃深低温技术结合细胞冷冻保护液是实现细胞长期保存的最有效方法，也是间充质干细胞未来临床应用的关键之一。[0005]到目前为止，细胞低温存储大多采用“慢冻快融”法，常用的冷冻保护液(即冻存液)中的二甲基亚砜(DMSO)的存在对神经系统有毒性作用，且使用动物源血清或异体血清有感染异种病毒的风险并引起异体基因免疫反应或补体反应的可能。

发明内容

[0006]有鉴于此，本发明提供了一种间充质干细胞通用无血清冻存液及其制备方法，在保证间充质干细胞深低温冻存条件下细胞活性不低于传统现有方法前提下，避免现有通用方法某些成分存在的低毒性和补体反应带来的潜在风险。[0007]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％。[0008]可选地，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。[0009]本发明还公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤：

[0010]步骤1、在正常工作的生物安全柜中，按照体积百分比称量以下组分：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基

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25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％；[0011]步骤2、在正常工作的生物安全柜中，空气净化LED灯变绿，准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；[0012]步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格；[0013]步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；[0014]步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。

[0015]本发明还公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

[0016]步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过80-85％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜，消化至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；[0017]步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；[0018]步骤3、离心收集细胞：将离心管配平进行离心，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；

[0019]步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；[0020]步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；[0021]步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。[0022]可选地，胰蛋白酶的质量百分含量为0.125％－0.25％，消化时间为1－2min。[0023]可选地，离心转速为1000-1200rpm/min，离心时间为5分钟。[0024]可选地，收集的细胞的终密度1*10^6-2*10^7/ml。[0025]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

[0026]1)本发明的间充质干细胞通用无血清冻存液适用于各种来源的间充质干细胞比如脂肪、脐带、胎盘、骨髓、脐带血、羊膜、子宫内膜等，细胞冻存后复苏活性不低于传统冻存液(高于90％)。

[0027]2)本发明的间充质干细胞通用无血清冻存液不含有传统冻存液有毒成分DMSO、传统冻存液的动物血清成分或异体血清成分，有效避免了异源血清带来的补体反应和病毒感染潜在风险。

[0028]3)本发明的间充质干细胞通用无血清冻存液支持高密度冻存MSC细胞(2*10^7/ml)，为常规血清冻存液的5-10倍。[0029]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明

[0030]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

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图1是本发明实施例1采用通用无血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后0h的状态图2是本发明实施例1采用通用无血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后0h的状态图3是本发明实施例1采用传统血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后3d的状态图4是本发明实施例1采用传统血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后3d的状态图5是本发明实施例2采用通用无血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后0h的状态图6是本发明实施例2采用通用无血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后0h的状态图7是本发明实施例2采用传统血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后3d的状态图8是本发明实施例2采用传统血清冻存液处理的脐带MSC细胞复苏后3d的状态

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具体实施方式

[0039]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。[0040]本发明公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液0.5％-10％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％。[0041]其中，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。[0042]间充质干细胞通用无血清冻存液主要有两大组分构成，即稳定剂和保护剂两大类成分物质构成，其中稳定剂成分主要由细胞制备、扩增培养所需的营养基质成分如无血清培养基、非必须氨基酸、血清替代物、维生素等保证细胞在深低温条件下的营养需求和细胞功能的保持；保护剂成分主要由具有渗透性的小分子物质如甘油以及非渗透性的大分子物质如人血白蛋白、羟乙基淀粉(130/0.4)即HES、复方右旋糖酐等组成，在冷冻悬液完全凝固前，渗入胞内，产生一定摩尔浓度降低胞内外未结冰溶液的浓度，避免细胞结晶起到保证细胞活性作用。

[0043]本发明采用具有渗透性的小分子保护剂和非渗透性的大分子保护剂，充分利用两类物质在“避免因细胞冻存过程因结晶活性降低”的有益叠加效应：小分子渗透到胞内产生一定摩尔浓度，降低胞内外未结冰溶液浓度；大分子优先同溶液中的水分子结合，降低自由水含量，使冰点降低，减少冰晶形成同时由于分子量大使溶液中电解质浓度降低减轻了溶质损伤。

[0044]本发明组分，未采用具有神经系统有毒性作用的DMSO成分，对于冻存细胞用于临床研究安全性提供了保证，以及血清成分有效避免使用动物源血清或异体血清有感染异种

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病毒的风险并引起异体基因免疫反应或补体反应的可能。[0045]在上述的各组分的选值范围内，在满足细胞冻存液细胞功能活性设计要求前提下(活性高于传统含血清DMSO冻存液)，产品的经济成本较传统含血清DMSO冻存液低；若大于各组分的取值范围，经济成本明显升高且细胞冻存的功能活性并没有获得有意义的提高(忽略不计)；若低于各组分的取值范围，细胞基本稳定成分和保护剂成分不足以维持细胞在深低温冷冻条件下的细胞功能，细胞活性明显降低。

[0046]本发明还公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤：

[0047]步骤1、称量：按照体积百分比称量以下组分：复方右旋糖酐40注射液0.5-10％，羟乙基淀粉130/0.41％-10％，甘油5％-30％，无血清培养基25％-70％，血清替代物0.5％-1％，人血白蛋白20％-40％,维生素C 0.05％-1％，维生素E 0.2％-1％，非必须氨基酸0.5％-3％，以上质量百分含量总量为100％；[0048]步骤2、在正常工作的生物安全柜中(空气净化LED灯变绿)，准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；[0049]步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物检测、内毒素检测、支原体检测均为阴性，判断为合格；[0050]步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；[0051]步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。

[0052]本发明还公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，包括以下步骤：

[0053]步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过80-85％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入质量百分含量为0.125％－0.25％胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜(过多酶造成细胞破裂死亡)消化1－2min至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；[00]步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；[0055]步骤3、离心收集细胞：将离心管配平放入转速为1000-1200rpm/min的离心机中,离心5分钟，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；[0056]步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀按细胞终密度1*10^6-2*10^7/ml，加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；[0057]步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；[0058]步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。[0059]在上述方法中，采用质量百分含量为0.125％－0.25％胰蛋白酶可以消化贴壁生长间充质干细胞，利用新鲜培养基无血清培养基(Lonza UItraCULTURETM)的弱碱性终止弱酸性的胰蛋白酶的过度反应造成细胞损伤死亡，本发明通用无血清冻存液——细胞冻存功能活性保护剂；

[0060]胰蛋白酶质量百分含量高于0.25％酶过度反应会对细胞损伤造成收集细胞活性低，低于0.125％贴壁细胞不能脱落浪费细胞资源；消化时间大于2min酶过度反应对细胞损

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伤造成收集细胞活性低，消化时间小于1min过贴壁细胞不能脱落浪费细胞资源；离心转速高于1200rpm/min离心力大，细胞物理破裂，收集细胞活性降低，转速低于1000rpm/min细胞不能完全离心收集沉淀浪费细胞资源。[0061]实施例1

[0062]一种间充质干细胞通用无血清冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液0.5％，羟乙基淀粉(130/0.4)1.5％，甘油5％，无血清培养基70％，血清替代物0.5％，人血白蛋白20％,维生素C 1％，维生素E 1％，非必须氨基酸0.5％，以上质量百分含量总量为100％。[0063]其中，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。[00]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液通过以下方法制备得到：[0065]步骤1、称量：按照上述的体积百分比称量各组分；[0066]步骤2、准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；[0067]步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物检测、内毒素检测、支原体检测均为阴性，判断为合格；[0068]步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；[0069]步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。[0070]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，包括以下步骤：[0071]步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过82％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入质量百分含量为0.20％胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜(过多酶造成细胞破裂死亡)消化1.5min至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；[0072]步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；[0073]步骤3、离心收集细胞：将离心管配平放入转速为1100rpm/min的离心机中,离心5分钟，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；[0074]步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀按细胞终密度1*10^6/ml，加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；[0075]步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；[0076]步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。[0077]脐带MSC细胞冻存时间与复苏活率对照表见表1。[0078]表1脐带MSC细胞冻存时间与复苏活率对照表

[0079]

细胞

脐带MSC(通用无血清冻存)脐带MSC(传统血清冻存)细胞

脐带MSC(通用无血清冻存)脐带MSC(传统血清冻存)1个月98％93％7个月95％90％2个月98％93％8个月95％90％

7

3个月98％93％9个月95％88％4个月98％93％10个月95％88％5个月96％90％11个月93％85％6个月96％90％12个月93％85％

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从表1和图1-图4中可知用脐带来源的间充质干细胞(MSC)作为本发明冻存液和传

统血清冻存液复苏活率的对比目标，在一年的-196℃深低温冻存条件下，采用本发明通用无血清冻存液冻存的细胞活性均明显高于传统血清冻存液。[0081]实施例2

[0082]一种间充质干细胞通用无血清冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液10％，羟乙基淀粉(130/0.4)10％，甘油30％，无血清培养基25％，血清替代物1％，人血白蛋白23.25％,维生素C 0.05％，维生素E 0.2％，非必须氨基酸0.5％，以上质量百分含量总量为100％。[0083]其中，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。[0084]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液通过以下方法制备得到：[0085]步骤1、称量：按照上述的体积百分比称量各组分；[0086]步骤2、准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；[0087]步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物检测、内毒素检测、支原体检测均为阴性，判断为合格；[0088]步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；[00]步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。[0090]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，包括以下步骤：[0091]步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过80-85％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入质量百分含量为0.125％胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜(过多酶造成细胞破裂死亡)消化1min至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；[0092]步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；[0093]步骤3、离心收集细胞：将离心管配平放入转速为1000rpm/min的离心机中,离心5分钟，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；[0094]步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀按细胞终密度2*10^7/ml，加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；[0095]步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；[0096]步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。[0097]脂肪MSC细胞冻存时间与复苏活率对照表见表2。[0098]表2脂肪MSC细胞冻存时间与复苏活率对照表

[0099]

细胞

脂肪MSC(通用无血清冻存)脂肪MSC(传统血清冻存)细胞

脂肪MSC(通用无血清冻存)脂肪MSC(传统血清冻存)1个月98％92％7个月96％88％2个月98％92％8个月95％88％

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3个月98％92％9个月95％85％4个月98％90％10个月93％85％5个月98％90％11个月93％85％6个月96％90％12个月93％85％

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从表1和图5-图8中可知用脂肪来源的间充质干细胞(MSC)作为本发明冻存液和传

统血清冻存液复苏活率的对比目标，在一年的－196℃深低温冻存条件下，采用本发明通用无血清冻存液冻存的细胞活性均明显高于传统血清冻存液；同时也证明了，本发明的通用无血清冻存液在适用于多种来源的间充质干细胞冻存时，其细胞冻存的活性稳定性是可靠的。

[0101]实施例3

[0102]本发明公开了一种间充质干细胞通用无血清冻存液，按照体积百分比由以下组分构成：复方右旋糖酐40注射液5％，羟乙基淀粉(130/0.4)1％，甘油20％，无血清培养基29.1％，血清替代物0.8％，人血白蛋白40％,维生素C 0.5％，维生素E 0.6％，非必须氨基酸3％，以上质量百分含量总量为100％。[0103]其中，无血清培养基为Lonza UItraCULTURETM；血清替代物为Pall UltroserTM。[0104]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液通过以下方法制备得到：[0105]步骤1、称量：按照上述的体积百分比称量各组分；[0106]步骤2、准备无菌无热源血清方瓶，依次加入各组成成分充分搅拌混匀；[0107]步骤3、采用0.2um过滤器，对上述混匀后的混合液进行无菌过滤到新的无菌无热源血清方瓶中，并取样进行微生物检测、内毒素检测、支原体检测均为阴性，判断为合格；[0108]步骤4、盖上血清方瓶瓶盖，封口膜瓶盖密封；[0109]步骤5、制备好的冻存液，置于2-8℃医用冰箱冷藏。[0110]上述的间充质干细胞通用无血清冻存液的冻存方法，包括以下步骤：[0111]步骤1、细胞收集：准备冻存的间充质干细胞生长密度超过80-85％以上，PBS缓冲液清洗1-2遍，加入质量百分含量为0.25％胰蛋白酶刚好铺满细胞培养瓶底面为宜(过多酶造成细胞破裂死亡)消化2min至贴壁的间充质干细胞脱落80％后，加入新的无血清培养基终止消化，用血清移液管转移入离心管中；[0112]步骤2、细胞活性计数:离心前，将离心管中的细胞液充分混匀取少量用血球计数板进行细胞活性计数，计算细胞总量；[0113]步骤3、离心收集细胞：将离心管配平放入1200rpm/min,离心5分钟，离心后保留沉淀物弃上清液收集细胞；[0114]步骤4、加入细胞冻存液：收集的细胞沉淀按细胞终密度2*10^7/ml，加入间充质干细胞通用无血清冻存液,用血清移液管充分混匀，分装入2ml的冻存管，密封标注；[0115]步骤5、程序降温：分装好的细胞冻存管，放入程序降温仪梯度降温或程序降温盒-80℃冰箱过夜；[0116]步骤6、深低温液氮冻存：转入-196℃气相液氮罐长期保存。[0117]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

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