(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109122670 A(43)申请公布日 2019.01.04
(21)申请号 201811340103.7(22)申请日 2018.11.12
(71)申请人 王晓柯
地址 100094 北京市海淀区丰贤中路7号B
座一层(72)发明人 李海峰 张莹莹 (51)Int.Cl.
A01N 1/02(2006.01)
权利要求书5页 说明书8页 附图4页
(54)发明名称
一种临床级别无血清细胞冻存液(57)摘要
本发明公开了一种无血清细胞冻存液，由氨基酸组分、无机盐组分、细胞外冷冻保护剂、细胞内冷冻保护剂等组成。本发明的细胞冻存液，含有双重保护成份，从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了细胞的复苏率，适应广泛的细胞系保存（可用于细胞长期的保存，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，临床间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的所有哺乳动物细胞的长期保存），同时本发明的细胞冻存液中为完全无血清、无蛋白、无DMSO冻存液，避免了临床应用中引入的异种外源成份，更加安全。CN 109122670 ACN 109122670 A
权 利 要 求 书
1/5页
1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；CuSO4·5H2O 0．0005～0.005；L-天门冬酰胺25～75；L-天门冬氨酸10～30；L-谷氨酸 10～30；Ni（NO3）2· 6H2O 0．00002～0.0002；L-谷氨酰胺 0～500；ZnSO4· 7H2O 0．06～0.6；甘氨酸 5～15；CoCl2· 6H2O 0．001～0.008；L-组氨酸10～30；NaSiO3· 9H2O 0.001～0.01；L-异亮氨酸 25～75；Na3VO4· 12H2O 0.0005～0.005；L-赖氨酸盐酸20～60；SnC12· 2H2O 0．00001～0.0001；L-蛋氨酸10～30；Na2SeO3 0．002～0.01；L-苯丙氨酸10～30；FeSO4· 7H2O 0．2～1.6；L-脯氨酸10～30；葡萄糖 1000～4000；L-丝氨酸15～45；维生素C O.176～0．704；L-苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0．5～1．5；L-色氨酸5～15；丙酮酸钠 55～550；L-缬氨酸1O～30；亚油酸 0．01～0.05；L-亮氨酸 25～75；β-巯基乙醇 0．8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；L-胱氨酸二盐酸25～75；
细胞外冷冻保护剂1000～6000；细胞内冷冻保护剂1000～6000；余量为水。
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权 利 要 求 书
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2.根据权利要求1所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：所述细胞外冷冻保护剂选自羟乙基淀粉。
3.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 200；CuSO4·5H2O 0．001；L-天门冬酰胺50；L-天门冬氨酸20；L-谷氨酸 20；Ni（NO3）2· 6H2O 0．0001；L-谷氨酰胺 250；ZnSO4· 7H2O 0．3；甘氨酸 10；CoCl2· 6H2O 0．004；L-组氨酸20；NaSiO3· 9H2O 0.005；L-异亮氨酸 50；Na3VO4· 12H2O 0.002；L-赖氨酸盐酸40；SnC12· 2H2O 0．00005；L-蛋氨酸20；Na2SeO3 0．006；L-苯丙氨酸20；FeSO4· 7H2O 1.0；L-脯氨酸20；葡萄糖 2500；L-丝氨酸30；维生素C O.500；L-苏氨酸20；
对羟基苯甲酸1.0；L-色氨酸10；丙酮酸钠 300；L-缬氨酸20；亚油酸 0．03；L-亮氨酸 50；β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；L-胱氨酸二盐酸50；细胞外冷冻保护剂2500；
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权 利 要 求 书
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细胞内冷冻保护剂 3000；余量为水。
4.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100；CuSO4·5H2O 0．0005；L-天门冬酰胺75；L-天门冬氨酸30；L-谷氨酸 10；Ni（NO3）2· 6H2O 0．00002；L-谷氨酰胺 500；ZnSO4· 7H2O 0.6；甘氨酸 5；CoCl2· 6H2O 0．001；L-组氨酸30；NaSiO3· 9H2O 0.01；L-异亮氨酸 25；Na3VO4· 12H2O 0.0005；L-赖氨酸盐酸60；SnC12· 2H2O 0.0001；L-蛋氨酸10；Na2SeO3 0．002；L-苯丙氨酸30；FeSO4· 7H2O 0． 1.6；L-脯氨酸10；葡萄糖 1000；L-丝氨酸45；维生素C 0.704；L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；L-色氨酸15；丙酮酸钠 550；L-缬氨酸1O；亚油酸 0．01；L-亮氨酸 75；β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；L-胱氨酸二盐酸25；细胞外冷冻保护剂1000；
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权 利 要 求 书
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细胞内冷冻保护剂1500；余量为水。
5.根据权利要求1或2所述的无血清细胞冻存液，其特征在于：是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 300；CuSO4·5H2O 0.005；L-天门冬酰胺25；L-天门冬氨酸10；L-谷氨酸 30；Ni（NO3）2· 6H2O 0.0002；L-谷氨酰胺 100；ZnSO4· 7H2O 0．06；甘氨酸 15；CoCl2· 6H2O 0.008；L-组氨酸10；NaSiO3· 9H2O 0.001；L-异亮氨酸 75；Na3VO4· 12H2O 0.005；L-赖氨酸盐酸20；SnC12· 2H2O 0．00001；L-蛋氨酸30；Na2SeO3 0.01；L-苯丙氨酸10；FeSO4· 7H2O 0.2；L-脯氨酸30；葡萄糖 4000；L-丝氨酸15；维生素C O.176；L-苏氨酸30；
对羟基苯甲酸1.5；L-色氨酸5；丙酮酸钠 55；L-缬氨酸30；亚油酸 0.05；L-亮氨酸 25；β-巯基乙醇 0.8；
二水L-酪氨酸二钠432；L-胱氨酸二盐酸75；细胞外冷冻保护剂5000；
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权 利 要 求 书
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细胞内冷冻保护剂6000；余量为水。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的无血清细胞冻存液的制备方法，其特征在于：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如权利要求1～5中任一项所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的无血清细胞冻存液在冻存细胞中的应用。
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说 明 书
一种临床级别无血清细胞冻存液
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技术领域
[0001]本发明涉及一种临床级别无血清细胞冻存液。
背景技术
[0002]细胞冻存液在保存细胞时，通过冷冻保护剂在冻存过程对细胞进行保护，传统的细胞保护剂仅为细胞内保护剂，细胞受冻存时容易受到冰晶的损伤，细胞复苏率低，无法有效保护细胞。另外，现有技术中的细胞冻存液通常含有动物源性物质，成分复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率，同时目前大多数冻存液都含有DMSO（二甲基亚砜），临床应用存在一定的毒性。发明内容
[0003]针对上述现有技术，本发明提供了一种临床级别无血清细胞冻存液，可用于细胞长期的保存，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，临床间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的所有哺乳动物细胞的长期保存，同时冻存液中不含DMSO成分，以及动物源成分，更安全，符合临床需要。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的：
一种临床级无血清细胞冻存液，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：
L-精氨酸 100～300；CuSO4·5H2O 0.0005～0.005；L-天门冬酰胺25～75；L-天门冬氨酸10～30；L-谷氨酸 10～30；Ni（NO3） 6H2O 0.00002～0.0002；2·L-谷氨酰胺 0～500；ZnSO4· 7H2O 0.06～0.6；甘氨酸 5～15；CoCl2· 6H2O 0.001～0.008；L-组氨酸10～30；NaSiO3· 9H2O 0.001～0.01；L-异亮氨酸 25～75；Na3VO4· 12H2O 0.0005～0.005；L-赖氨酸盐酸20～60；SnC12· 2H2O 0.00001～0.0001；L-蛋氨酸10～30；Na2SeO3 0.002～0.01；
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说 明 书
2/8页
L-苯丙氨酸10～30；FeSO4· 7H2O 0.2～1.6；L-脯氨酸10～30；葡萄糖 1000～4000；L-丝氨酸15～45；维生素C O.176～0.704；L-苏氨酸10～30；对羟基苯甲酸0．5～1.5；L-色氨酸5～15；丙酮酸钠 55～550；L-缬氨酸1O～30；亚油酸 0.01～0.05；L-亮氨酸 25～75；β-巯基乙醇 0.8～4.0；
二水L-酪氨酸二钠144～432；L-胱氨酸二盐酸25～75；
细胞外冷冻保护剂1000～6000；细胞内冷冻保护剂 1000～6000；余量为水。
[0005]所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉。[0006]所述细胞内冷冻保护剂为甘油。
[0007]本发明的临床级无血清细胞冻存液的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。[0008]本发明的细胞冻存液，含有双重保护成份，从细胞内和细胞外同时保护细胞免受冻存时冰晶的损伤，大大提高了细胞的复苏率，适应广泛的细胞系保存，同时本发明的细胞冻存液中为完全无血清冻存液，避免了临床应用中引入的异种外源成份，更加安全。[0009]本发明的细胞冻存液，提高了细胞冻存的复苏率，细胞冻存适应性更广泛，冻存复苏率平均达到90%以上，同时该产品可保存于2～8℃，冻存细胞时无需程序降温，可直接置于-80℃冻存，12h后直接置于液氮保存，在操作上简化了大量的冻存程序，同时产品更稳定，无需担心反复冻融对产品的影响。附图说明
[0010]图1：采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片。[0011]图2：采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片。[0012]图3：采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏48小时后的照片。[0013]图4：采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏48小时后的照片。[0014]图5：采用本发明的细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。[0015]图6：采用传统细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。
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说 明 书
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图7：采用本发明的细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。图8：采用传统细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。图9：采用本发明的细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏的照片。图10：采用传统细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏的照片。图11：采用本发明的细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏48小时后的照片。图12：采用传统细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏48小时后的照片。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。[0023]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。[0024]实施例1 制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸 200；CuSO4·5H2O 0.001；L-天门冬酰胺50；L-天门冬氨酸20；L-谷氨酸 20；Ni（NO3） 6H2O 0.0001；2·L-谷氨酰胺 250；ZnSO4· 7H2O 0.3；甘氨酸 10；CoCl2· 6H2O 0.004；L-组氨酸20；NaSiO3· 9H2O 0.005；L-异亮氨酸 50；Na3VO4· 12H2O 0.002；L-赖氨酸盐酸40；SnC12· 2H2O 0.00005；L-蛋氨酸20；Na2SeO3 0.006；L-苯丙氨酸20；FeSO4· 7H2O 1.0；L-脯氨酸20；葡萄糖 2500；L-丝氨酸30；维生素C O.500；L-苏氨酸20；
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说 明 书
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对羟基苯甲酸1.0；L-色氨酸10；丙酮酸钠 300；L-缬氨酸20；亚油酸 0.03；L-亮氨酸 50；β-巯基乙醇 2.0；
二水L-酪氨酸二钠300；L-胱氨酸二盐酸50；细胞外冷冻保护剂2500；细胞内冷冻保护剂 3000；余量为水。
[0025]所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉，购自sigma，下同。[0026]制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。[0027]实施例2 制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸 100；CuSO4·5H2O 0.0005；L-天门冬酰胺75；L-天门冬氨酸30；L-谷氨酸 10；Ni（NO3） 6H2O 0.00002；2·L-谷氨酰胺 500；ZnSO4· 7H2O 0.6；甘氨酸 5；CoCl2· 6H2O 0.001；L-组氨酸30；NaSiO3· 9H2O 0.01；L-异亮氨酸 25；Na3VO4· 12H2O 0.0005；L-赖氨酸盐酸60；SnC12· 2H2O 0.0001；L-蛋氨酸10；Na2SeO3 0.002；L-苯丙氨酸30；FeSO4· 7H2O 0.16；L-脯氨酸10；
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说 明 书
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葡萄糖 1000；L-丝氨酸45；维生素C 0.704；L-苏氨酸10；
对羟基苯甲酸0.5；L-色氨酸15；丙酮酸钠 550；L-缬氨酸10；亚油酸 0.01；L-亮氨酸 75；β-巯基乙醇 4.0；
二水L-酪氨酸二钠144；L-胱氨酸二盐酸25；细胞外冷冻保护剂1000；细胞内冷冻保护剂 1500余量为水。[0028]制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。[0029]实施例3 制备细胞冻存液
是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为mg/L：L-精氨酸 300；CuSO4·5H2O 0.005；L-天门冬酰胺25；L-天门冬氨酸10；L-谷氨酸 30；Ni（NO3） 6H2O 0.0002；2·L-谷氨酰胺 100；ZnSO4· 7H2O 0.06；甘氨酸 15；CoCl2· 6H2O 0.008；L-组氨酸10；NaSiO3· 9H2O 0.001；L-异亮氨酸 75；Na3VO4· 12H2O 0.005；L-赖氨酸盐酸20；SnC12· 2H2O 0.00001；L-蛋氨酸30；Na2SeO3 0.01；
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说 明 书
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L-苯丙氨酸10；FeSO4· 7H2O 0.2；L-脯氨酸30；葡萄糖 4000；L-丝氨酸15；维生素C 0.176；L-苏氨酸30；
对羟基苯甲酸1.5；L-色氨酸5；丙酮酸钠 55；L-缬氨酸30；亚油酸 0.05；L-亮氨酸 25；β-巯基乙醇 0.8；
二水L-酪氨酸二钠432；L-胱氨酸二盐酸75；细胞外冷冻保护剂5000；细胞内冷冻保护剂 6000；余量为水。[0030]制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节pH 值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。[0031]实验 本发明的细胞冻存液的性能考察
利用本发明的细胞冻存液（实施例3制备），冻存细胞，冻存方式为：将细胞加入细胞冻存液中，直接置于-80℃冻存，12h后直接置于液氮保存。细胞复苏时，快复苏，加新鲜培养液，离心取出保护液。[0032]同时，以传统细胞冻存液（传统冻存液配方为：70%的DMEM+10%DMSO+20%的胎牛血清）为对照。也与日本ZENOAQ（厂家ZENOAQ，商品名称:cellbanker，商品号cellbanker2，）做对比。
[0033]使用方法的对比如表1所示（日本Q的使用方法同传统细胞冻存液）。细胞复苏率对比如表2所示。[0034]表1
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表2
由表2可见，采用本发明的细胞冻存液，可以不用梯度降温。细胞复苏率可达到90%以上，明显优于传统细胞冻存液和日本Q。[0035]NK2细胞的复苏对比图如图1、图2所示，图1为采用本发明的细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片，图2为采用传统细胞冻存液冻存NK2细胞并复苏的照片，复苏48小时后的照片如图3、图4所示。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复苏率（90%）明显优于传统细胞冻存液（80%）（通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高）。[0036]外周血单个核细胞的复苏对比图如图5、图6所示，图5为采用本发明的细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片，图6为采用传统细胞冻存液冻存外周血单个核细胞并复苏的照片。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复苏率（90%）明显优于传统细胞冻存液（50%，碎片较多）。[0037]杂交瘤细胞的复苏对比图如图7、图8所示，图7为采用本发明的细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片，图8为采用传统细胞冻存液冻存杂交瘤细胞并复苏48小时后的照片。由对比可见，通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高。[0038]A549（肺癌细胞）的复苏对比图如图9、图10所示，图9为采用本发明的细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏的照片，图10为采用传统细胞冻存液冻存A549（肺癌细胞）并复苏的照片，复苏48小时后的照片如图11、图12所示。由对比可见，本发明的细胞冻存液的复
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苏率（95%）明显优于传统细胞冻存液（85%），通过复苏48小时后的照片可以得出细胞冻存后的存活率更高。
[0039]上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
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说 明 书 附 图
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图4
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图6
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说 明 书 附 图
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图7
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说 明 书 附 图
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图10
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