原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株

第２４卷第３期　２０１０年６月　高校化学工程学报　Ｎｏ．３、，０Ｉ．２４　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　Ｊｕｎｅ　２０１０　文章编号：１００３－９０１５（２０１０）０３—０４６２・０６　原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株　陈敏。．一，姚善泾　（１．浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州３１００２７；　２．浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州３１００１　２）　摘要：通过对刺芹侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ＧＩＭ　５．２８０）原生质体开展复合诱变及传代培养，以期得到遗传稳定的木质素　降解酶高产菌株。结果表明，通过２５　Ｓ紫外诱变刺芹侧耳原生质体，正突变率达１６％。对紫外诱变正突变株进行　Ｃｏ７　二次复合诱交再生，获得五株正突变突出菌株。经过摇瓶发酵实验，发现这五株菌株产木质素降解酶能力较出发菌株　明显提高。同时开展高产菌株的传代培养，检验其传代稳定性。连续传代四代铡试结果表明。００７号和１６７号菌株遗　传的稳定性表现突出，发酵液中木质素降解酶产量稳定。尤其是００７号菌株产酶可达到ＩＩＯ　Ｕ・ｍＬ一，比出发菌株的酶　活表达量提高５４＿３％。复合诱变能明显提高刺芹侧耳产木质素降解酶能力。　关键词：刺芹侧耳，原生质体，复合诱变，木质素降解酶　中图分类号：ＴＱ９２６　文献标识码：Ａ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｏｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｈｉｇｈ—Ｙｉｅｌｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ＣＨＥＮ　Ｍｉｎ　．－，ＹＡＯ　Ｓｈａｎ－ｊｉｎｇ。　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊ　ｉｎｇ　ａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１　００２７，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊ　ｉａｎｇ　Ｇｏｎｇｓｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１　００　１　２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ　ｆｕｎｇｕｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｕｓｉｎｇ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇＴｉ　ＧＩＭ　５．２８０　ａｓ　ｓｔａｒｔｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ．ｔｈｅ　ＵＶ　ａｎｄ　Ｃｏ７　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ａｎｄ　ｓｅｒｉａｌ　ｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈｉｇｈ・ｙｉｅｌｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ，ｆｏｒ　ＵＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　２５　ｓｅｃｏｎｄｓ　ｉｓ　ｓｕｆｉｃｉｆｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｒｗａｒｄ　ｍｕｔａｔｉｆｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　ｕｐ　ｔｏ　１　６％．Ａｆｔｅｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ印Ｃｏｙ　ｉｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｆｉｖｅ　ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ　ｍｕｔａｎｔｓ　，ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅｓｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｒｅ　ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ　ｆｏｕｒ　ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　００７　ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎ　１　６７　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　００７　ｒｅａｃｈｅｓ　１　１　０　Ｕ・ｍＬ～ｗｈｉｃｈ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　５４＿３％ａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｈ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｔｖｉｔｙ　ｏｆ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｓｔｕｄｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｈａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆＰｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　１前　言　白腐真菌是一类腐生在木头上，对木质素有较强的分解能力并能造成木头白腐的丝状真菌的统称，　多数是担子菌纲微生物，少数为子囊菌纲的微生物【¨。木质素是一种复杂的聚合物，主要由苯丙烷等单　体通过各种Ｃ－Ｃ键和醚键相连而成。由于木质素立体结构的复杂性，使得一般微生物及其酶很难侵染和　收稿日期：２００９－０６－２３；修订日期：２００９．Ｉ１－１２。　作者简介；￣（１９７４・）－女・浙江杭州人．浙江工商大学副教授，浙江大学博士生。通讯联系人：姚善泾．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｓｊ￣ｚｊｕ．￣ｄｕ．ｃｎ　第２４卷第３期　陈敏等：原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株４６３　进入，导致木质素的降解成为地球生物圈中碳素循环的主要障碍［２１。白腐真菌因其具有完全降解木质纤　维素的能力引起了人们的兴趣【３】。人们发现，木质素的降解是靠白腐真菌生长过程中分泌的多种酶共同　作用来完成的，这些酶统称为木质素降解酶。其中有些具有特殊催化功能的酶，如漆酶、芳基乙醇酶、　多功能过氧化物酶、木质素过氧化物酶等［４，５１，由于它们作用底物的机制是夺取底物电子和形成自由基，　使得它们可作用的底物不是一种而是一类或几类有机化合物，因此它们不仅能应用于木质素降解，还对　多环芳烃类化合物和染料等表现出较强的生物降解性［６，７１。因此选育高产木质素降解酶的自腐真菌，具有　重要的现实意义。诱变育种可提高菌种突变率【８】，并能较大程度改变诱变对象的遗传性状，常作为真菌　菌种选育的首选手段。迄今，在担子菌中利用原生质体诱变技术提高其某一方面生产性状（如木质素降解　酶产量、多糖含量等）已有成功报道【９．１。。。　刺芹侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉＯ隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属ｌｌ”，是重要白腐真　菌之一，具有较强的木质素降解能力【ｌ　。目前国内外对其菌种选育、分泌的木质素降解酶种类、性质的　研究和利用报道较少。本研究将以刺芹侧耳菌株为出发菌株，对其原生质体进行复合诱变。通过初筛培　养基设计，快速筛选高产木质素降解酶的菌株。然后进行继代培养，验证其遗传稳定性，为今后进一步　将其应用于印染废水处理等环保领域打下基础。　２材料和方法　２．１菌种　刺芹侧耳　ｅｒｙｎｇｉｉ）ＧＩＭ　５．２８０菌株：购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。　２．２培养基　平板与斜面培养基（ＰＤＡ）：２０％土豆汁，２％的葡萄糖，２％琼脂，ｐＨ自然。　原生质体再生培养基：１％麦芽糖，０．４％蔗糖，０．４％酵母粉，０．７％琼脂，用０．６　ｍｏｌ・Ｌ－　甘露醇为渗透　压稳定剂配制，ｐＨ自然。　初筛平板培养基：１％麦芽糖，２％葡萄糖，０．２％酵母膏，０．２％蛋白胨，０．０５％ＭｇＳＯ４＂７１－１２０，０．４％　ＫＨ２ＰＯ４，２％琼脂，０．５　ｍｍｏ１．Ｌ　愈创木酚。　发酵培养基（ＣＹＭ）：ｌ％麦芽糖，２％葡萄糖，０．２％酵母膏，０．２％蛋白胨，Ｏ．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０．４％　ＫＨ２ＰＯ４。　２．３实验方法　２．３．１菌丝体培养及原生质体的制备【”】　将刺芹侧耳（ＧＩＭ　５．２８０）斜面菌种转接于液体ＰＤＡ上进行培养，温度２３℃，摇床转速１５０　ｒ・ｍｉｎ～，　培养４　ｄ，过滤离心洗涤菌丝体。按文献【ｌ３】所示方法制备刺芹侧耳原生质体，备用。　２．３．２原生质体ＵＶ诱变　取１０　ｍＬ，浓度为１０　个・ｍＬ　的原生质体悬浮液于直径为９　ｃｍ的平皿内，置于紫外灯下０５　Ｗ，距　离３０　ｃｍ）分别照射不同时间。照射结束后，取经一定稀释的１００　ｇＬ原生质体悬浮液与再生培养基混合，　倒平板，２３℃避光培养。　２＿３．３　原生质体　。Ｃｏｙ诱变【ｌ４】　将制得的原生质体悬浮液进行６。Ｃｏｙ射线辐照处理（浙江大学辐照中心），辐照剂量为１０００　Ｇｙ，剂量　率为６７．８　Ｇｙ．ｈ～。辐照完毕后取１００　ｇＬ原生质体悬浮液与再生培养基混合，倒平板，２３＂Ｃ避光培养。　２．３．４高产菌株的筛选　初筛：从再生培养基上随机挑取２００个再生单菌落，用直径为６　ｍｍ的打孔器制备菌种块，接种于　含有愈创木酚初筛培养基中。２３℃培养４　ｄ后，测量诱变菌株的显色圈／菌落直径的比值，同时观察显色　圈棕红色的深浅，并与原始菌株的相应数值和颜色比较，以筛选出正突变菌株。　复筛：将正突变性状突出的初筛菌株接种于发酵培养基中。２３℃，１５０　ｒ・ｍｉｎ　条件下，摇瓶培养。　每天测定发酵液中木质素降解酶酶活，确定高产木质素降解酶菌株，同时进行菌种保藏。　高校化学工程学报　２０１０年６月　２．３．５高产菌株的稳定性测试　将高产木质素降解酶菌株每５　ｄ转接一次ＰＤＡ平板，同时进行液体发酵，测定每代菌株发酵液第８　天的木质素降解酶酶活。连续进行４代传代实验，以测试高产菌株的遗传稳定性。　２．４分析方法　２．４．１　木质素降解酶酶活测定【ｌ　刺芹侧耳是重要的白腐真菌之一，它具有分泌催化多种底物的木质素降解酶的能力。由于　ＡＢＴＳ．（ＮＩ－ｈ）２是这些酶都能作用的底物，因此建立以ＡＢＴＳ．（ＮＨ４）２为底物的催化体系来表征刺芹侧耳发　酵液中木质素降解酶的酶活。　ｌ　ｍＬ反应液体系中含有０．１　ｍＬＡＢＴＳ．　Ｉ－Ｉ４）２（５　ｍｍｏｌ・Ｌ　），０．５　ｍＬ乙酸钠ｐＨ＝５．０（Ｏ．１　ｍｏｌ・Ｌ　）和０．４　ｍＬ经一定稀释的样品液，室温下测４３６　ｎ／ｌｌ波长下的吸光度变化。　酶活力单位定义：每ｍＬ反应液中每ｍｉｎ生成１　ｐ，ｍｏｌ产物所需酶量定义为一个酶活力单位（Ｕ）。其　消光系数Ｆ－４３６＝２９３００　Ｌ．ｍｏｉ－Ｌｃｍ－。。　２．４．２原生质体的致死率　致死　一　２．４．３数据处理　淼×．ｏ。％　采用ＤＰＳ统计软件进行数据统计分析。各处理间实验数据以平均数４－标准差表示，各处理平均值采　用方差分析中的Ｔｕｋｅｙ法进行显著性分析。　３结果及讨论　３．１紫外诱变剂量的确定　紫外线（ＵＶ）诱变的作用机理是通过在ＤＮＡ序列中形成嘧啶二聚体，阻碍ＤＮＡ复制时碱基的正常配　对，导致ＤＮＡ损伤，突变株产生。原生质体因缺乏细胞壁的保护，染色体ＤＮＡ易引起突变。本实验采　用紫外线对刺芹侧耳原生质体分别照射０，１０，ｌ５，２Ｏ，２５，３０，４Ｏ，５０　Ｓ，再生结果见图ｌ。　由图ｌ可知，刺芹侧耳原生质体经紫外线照射后再生菌落数随时间的延长开始减少，在０～３０　Ｓ照射　时间内，致死效应变化非常大。３０　Ｓ时，原生质体的致死率已达７３．１７％。３０　ｓ以后，上升趋于平缓。根　据李刚、张红梅等［１６，１７］对担子菌原生质体紫外诱变的研究，一般选择原生质体半致死率时的照射剂量为　最佳的诱变时间，菌株正突变率高。由图ｌ可知，刺芹侧耳的半致死率时的照射剂量约为２５　ｓ，因此选　择紫外线诱变剂量为２５　Ｓ的刺芹侧耳原生质体再生平板（图２）作为初筛的菌株来源。　案　岩　．Ｑ　盏　图１　刺芹侧耳ＧＩＭ５．２８０原生质体紫外诱变致死效应　Ｆｉｇ・１　Ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ＣＨＩＶｅ　ｏｆＰ．ｅｒｙｎｇｉｉ（ＧＩＭ５．２８０）　图２刺芹侧耳原生质体再生（紫外诱变２５　ｓ）　Ｆｉｇ２　Ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｒｏｍ　Ｐｒｙｎｇｉｉ　（２５　ｓ　ＵＶ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｂｙ　ＵＶ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ３．２紫外突变株的初筛　为了获取高产具有多种底物催化能力的木质素降解酶菌株，本实验选取愈创木酚作为初筛物。那些　能与初筛培养基中的愈创木酚反应的木质素降解酶将产生棕红色圈，根据棕红色圈／菌落直径的比值大　第２４卷第３期　陈敏等：原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株　小，并结合显色圈颜色的深浅，可以初步确定再生菌株木质素降解酶产量的高低。从紫外照射２５　Ｓ的再　生平皿中随机挑取２００个单菌落，接种到初筛平板培养基中，２３￣Ｃ培养４　ｄ。结果如图３所示（中格菌株　是刺芹侧耳ＧＩＭ　５．２８０菌株，作为对照１。　通过测定显色圈／菌落直径的比值大小及观察显色圈的色泽深浅，从２００个初筛菌株中发现３２个菌　株其比值和色泽均优于ＧＩＭ５．２８０菌株（显色圈／菌落直径的比值为１．７８，显色圈颜色为棕红色），正突变　率达１６％。选取了其中显色圈呈深棕红色，相应比值最大的五株正突变菌株（显色圈／菌落直径的比值在　２．Ｏ５～２．３ｌ范围内）进行６ｏＣｏｙ诱变。　图３紫外诱变刺芹侧耳再生菌株初筛　Ｆｉｇ．３　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆＰ．ｅｒｙｎｇｉｉ　ｂｙＵＶ　图４刺芹侧耳原生质体再生Ｏ￣ｃｏ￣诱变）　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｐｍｔｏｐｌａｓｔ　ｒｏｍ　ｆＰｅｒｙｎｇｉｉ（ｏ０ｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　３．３原生质体　。Ｃｏ＇／诱变和６。Ｃｏｙ突变株的初筛　诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，因而本实验对初筛平板得到的五株紫外诱变正突变　菌株进行辐照剂量为１０００　Ｇｙ的６。Ｃｏｙ二次诱变，图４为刺芹侧耳紫外诱变正突变情况突出的０５１号菌　株制备得到的原生质体经∞Ｃｏｙ诱变的再生图片。图４的再生结果表明，复合诱变的再生率明显低于单　一紫外诱变的再生率。这是由于菌株经过ＵＶ诱变后，其ＤＮＡ已经受到损伤；再经过６。Ｃ０ｒｙ二次诱变，　从再生平皿中随机挑取２００个单菌落，接种到初筛平板培养基中，２３℃培养４　ｄ。通过测定显色圈／　其ＤＮＡ产生了更多损伤，因此致死率较单一诱变显著增加。　菌落直径的比值大小及观察显色圈色泽的深浅，从中筛选到显色圈呈棕红色，显色圈／菌落直径的比值大　于２－３１的二次诱变正突变菌株，结果见表１。　表１　ＣＯＴ正变株初筛结果　Ｔａｂｌｅ　１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｐ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｓｅｃｏｎｄａｒｉｌｙ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅｄ　ｂｙ　。ＣｏＴ　显色圈初筛结果表明，该５株菌株的产色圈直径／菌落直径的比值明显大于经一次诱变的出发菌株，　且显色圈棕红色也比其他突变株更深，因此选择它们进行发酵试验复筛，测定其分泌木质素降解酶的能　力。同时本实验结果表明复合诱变常常具有明显的协同诱变，虽然伴随着致死率的增加，但从中获得某　一方面遗传特性大幅度提高的诱变株的可能性也大大增加。　将００７、０１４、１３８、１０８、１６７号菌株接种于发酵培养基中，并于ｌ５０　ｒ．ｍｉｎ－　，２３℃条件下进行摇床　３．４印Ｃｏ７突变株的复筛　培养发酵，每天取样进行酶活测定，结果见图５。　从图５可以看出６菌株在ＣＹＭ液体培养基中分泌的木质素降解酶可以在第３天被测得，前５天发　酵液中酶活增加缓慢，第６天开始发酵液中酶活增加迅速，各菌株第６天发酵液中的酶活较第５天分别　高校化学工程学报　２０１０年６月　增长了１．７、０．７９、０．９６、１．７８、１．５７和１．２３倍。　一　第８天，６菌株发酵液中木质素降解酶的酶活达　至　到最高值。初筛的５个正突变菌株，分泌木质素　降解酶的能力较出发菌株都有了明显提高，其中　趸　００７号菌株正变效应最好，在第８天时发酵液中　的木质素降解酶的酶活达到ｌ１２．３７　Ｕ・ｍＬ～，较出　．　发菌株酶活提高了５４．３％。　暮　３．５正突变株稳定性测试　刺芹侧耳隶属于担子菌，其菌丝是双核菌　丝，菌丝生长是通过独特的锁状联合进行的。所　图５突变株木质素降解酶酶活变化　以原生质体制备过程中，会存在双核或者无核的　ｇ・　Ｔｈｅ“ｇｎｉｎｏ　。ｅｎｚｙｍｅｓｐｒｏｄｕｃｔ／锄　。　ｍ妇　删他　原生质体。因此正突变株可能会出现遗传性状分离现象，需要多次传代培养才能确定其突变性状的稳定　性。对５株正突变菌株进行菌种遗传稳定性测试，结果见表２。　表２突变株产木质素降解酶稳定性　Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｌｉ２ｎｉｎｏｌｖｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｖｒｏｄｕｃｆｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｓｔｒａｉｎ　ｃｏｄｅ　Ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ／Ｕ．ｍＬ’　ＧＩＭ５．２８０　００７　０１４　１０８　１３８　１６７　Ｆｉｒｓｔｇｅｎｅｒ∞如∞　ａｔｉｏｎ　如柏如　７２．８３±２．６１　０　１１２．３７±３．８３　１０３．５１＋２．１ｏａＡ　９８．９９±１．９６￣　９７．６８＋２２９￣Ａ　１０６２０：１：２２０　Ｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　７５．８９土３．１０　１１９８７±３．００　９０．９４±０．９７ｂｓ　９２２０土１２．２０ｈａｓ　８９．６７：１：２．１２ｂ＾Ｂ　１０１．．．２２±１．９ｏ　Ｔｈｉｒｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　７４．２４±４．０３　１０９９６±４．２８　８２．８１±１．９２￣ｃ　８７２１±２．９５ｂｃＢｃ　盯Ｏ９士４．Ｏ５吣　１００．．．．０５±２．９９　Ｆｏｕｒｔｈｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　７６．９５士３．０２　ｌ１Ｏ５６±３．９８　７８．８２±２．８９ｃｃ　８３７０－ｔ－１．５５￣ｃ　８３５０±１．０５ｍ　９９．．．．８６＋３．０１　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｓｕｐｃｒｓｃｎｐｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｎｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｍｅａｎｉｎｇ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：Ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｍａｌｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｅｘｐｔｅｓｓ　ｍｅ　ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ　ＩＳ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ【ｐ　＜０．０５），ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃａｐｉｔａｌ　ｌｅＲｅｒｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ　ｉｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｉｎｇｉｉｆｃａｎｔ（ｐ＜Ｏ．０１），ａｎｄ　ｈｔｅ　ｓａｍｅ　ｌｅｔｔｅｒ　ｏｆ￣ｐｈａｋｅｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｓｉｎｇｉｉｆｃａｎｔ（ｐ＞０．０５）．　从以上遗传稳定性试验可以得出：００７号菌株和１６７号菌株的木质素降解酶表达特性较稳定，四代　间差异不显著，　其连续传代后的第四代菌株酶活较第一代菌株仅分别降低了１．１７％和５．９３％，其中００７　号菌株不但遗传稳定性好，而且产酶能力略优于１６７号菌株，因此是本研究所获得的最佳诱变株。而０１４、　１０８、１３８三个菌株产酶性状不稳定，第一代菌株与第四代菌株差异极显著，其连续传代后的第四代菌株　酶活较第一代菌株酶活下降１０％以上，分别为２３．８６％、１５．４５％和１４．５２％，说明这三个菌株可能是双核　菌丝形成的原生质体诱变的产物，在传代过程中，发生了性状分离，表现为产酶特性下降。　４结　语　采用原生质体复合诱变技术，选育高产木质素降解酶的刺芹侧耳菌株是切实可行的。对刺芹侧耳原　生质体进行紫外诱变，结果表明在０～３０　Ｓ之间刺芹侧耳原生质体的致死率急剧增加，刺芹侧耳半致死率　的照射时间为２５　Ｓ。采用２５　Ｓ照射时间进行刺芹侧耳原生质体初筛，正突变率达１６％。对紫外诱变的正　突变株进行二次６。Ｃｏ７诱变，初筛获得五株正突变突出菌株。经过复筛发酵实验，发现这五株菌株在ＣＹＭ　培养基中木质素降解酶的表达较出发菌株有明显提高，它们都在第８天发酵液中酶活达到最大值。对筛　选的５株正突变株连续进行了４代遗传稳定性的测试。结果表明００７号和１６７号菌株遗传的遗传稳定性　表现突出，发酵液中木质素降解酶产量稳定。尤其是００７号菌株第８天发酵液中酶活高达ｌｌＯ　Ｕ．ｍＬ－　左　右，比出发菌株的酶活产量提高５４．３％。对该菌株进行菌种保藏，并命名为　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｓｔｒａｉｎ　ｃ。００７，用于　后续发酵优化、木质素降解酶组分分离及有机废水应用研究。结果将另文发表。　参考文献：　【ｔｌ　ＬＩ　Ｈｕｉ－ｒ０ｎｇ（李慧蓉）．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｗｈｉｔｅ　Ｒｏｔ　Ｆｕｎｇｉ（１￣腐真菌生物学和生物技术）［Ｍ】．Ｂｅｉｊｉｎｇ（北京）　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（化学工业出版社），２００５．　第２４卷第３期　陈敏等：原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株　４６７　ＷＵ　Ｋｕｎ（吴坤），ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｉ－嘲　ｍｉｎ（张世敏），ＺＨＵ　Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ（朱显峰）．Ｒｅｃｅｎｔ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏｎ　ｔ…　ｈｅ　ｌｉｇｎｉｎ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉ吲　ｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（木质素生物降解研究进展）【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（河南农业大学学报），２０００，３４（４）：　３４９—３５４．　ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｎｇ（张晶），ＨＵＡＮＧ　Ｍｉｎ－ｓｈｅｎｇ（黄民生），ＸＵ　Ｙａ・ｔｏｎｇ（徐亚同）．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｗｈｉｔｅ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ（白腐真菌木质素降解酶的研究及应用进展）【Ｊ】．Ｗａｔｅｒ　Ｐｕｒｉｉｆｃａｉｔｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（狰水技术），２００４，２３（１）：　１９－２１，２９．　Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｆ　Ｔ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆｆｕｎｇａｌ　ｌａｃｃａｓｅ【Ｊ】＿Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４０（１）：１９－２４．　Ｗｏｎｇ　Ｄ　Ｗ　Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ【Ｊ】．Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｅｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，１５７（２）：１７４・２０９．　Ｐｅｒｅｚｂｏａｄａ　Ｍ　Ｐ，Ｒｕｉｚｄｕｅｎａｓ　Ｆ　Ｊ，Ｐｏｇｎｉ　Ｒ　ｅｔ　ａ１．Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｒｅｄｏｘ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：　ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　ａｎｄ　ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｉ，２００５，３５４（２）：３８５－４０２．　ＧＡＯ　Ｅｎ・ｌｉ（高恩丽），ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｕ－ｊｉｎａｇ（张树江）’ⅪＡ　Ｌｉ－ｍｉｎｇ（夏黎明）．Ｌａｃｃａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒＭｃｏｌｏｒ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｎａｄ　ｉｔｓ　ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｉｎｄｉｇｏ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅ（￣芝菌发酵产漆酶及其对靛蓝脱色的研究）【Ｊ】．Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｕｎｉｖ（高　校化学工程学报），２００７，２ｌ（１）：ｌｌ１－１１５．　ＳＵＯ　Ｃｈｅｎ（索晨），ＭＥＩ　Ｌｅ—ｈｅ（梅乐和），ＨＵＡＮＧ　Ｊｕｎ（黄俊）ｅｔ　ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙ－ｐｏｌｙ　ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　Ｃｏ７　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ（　Ｃｏ＇／射线诱变选育聚谷氨酸高产菌株及培养基初步优化）［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｕｎｉｖ（高校化学工程学报），２００７，２　ｌ（５）：８２０．８２５．　ＺＨＡＮＧ　Ｙｕａｎ（张渊），ＷＡＮＧ　Ｑｉａｎ（王谦），ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｍｅｉ（张筱梅）ｅｔ　ａ１．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓ　ｓｔｒａｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｈｉ曲ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ（白灵侧耳木质素酶、纤维素酶高活性菌株的诱变选育）【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｙｔｆＮａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）（河北大学学报＜自然科学版＞），２００５，２５（６）：６５４－６５８．　ＷＡＮＧ　Ｑｉａｎ（￣Ｅ谦），ＧＯＮＧ　Ｊｉｎｇ（￣）ｑ，竞），ＪＩＮ　Ｌｉ—ｍｉｎｇ（金黎明）ｅｌ　ａ１．Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ　ｓｔｒａｗ　ｂｒｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（原生质体诱变技术选育糙皮侧耳秸秆分解菌株）【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（安　徽农业科学），２００８，３６（３２）：１３９３４－１３９３５．　ＷＡＮＧ　Ｃｈｅｎｇ－ｙｕ（王呈玉）．Ｔｈｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　Ｆｕｎｇｉ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎａ（中国侧耳属［Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ（Ｆｒ．）Ｋｕｍｍ．】真菌系统分类　学研究）【Ｄ】．Ｃｈａｎｇｃｕｎ（长春）：Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（吉林农业大学），２００４．　Ｃａｒｎａｒｃｒｏ　Ｓ，Ｓａｒｋａｒ　Ｓ，Ｒｕｉｚ—Ｄｕｅｆｌａｓ　Ｆ　Ｊ　ｅｌ　ａ１．Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎ　ｔｈａｔ　ｈａｓ　ｂｏｔｈ　ｍａｎｇａｎｅｓｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｌｉｇｎｉｎ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ【Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９９，２７４（１５）：１０３２４・１０３３０．　ＣＨＥＮ　Ｍｉｎ（陈敏），ＪＩＡＮＧ　Ｙｕ－ｊｉａｎ（蒋予箭），ＹＡＯ　Ｓｈａｎ－ｊｉｎｇ（￣善泾）ｅｔ　ａ１．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆＰｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　（杏鲍菇原生质体制备技术的研究）【Ｊ】．Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（食品科学），２００５，２６（８）：１５０．１５２．　ＸＩＡ　Ｚｈｉ・ｌａｎ（夏志兰），ＡＩ　Ｘｉｎ（艾辛），ＪＩＮＡＧ　Ｘｉｎｇ－ｊｉａｎ（姜性坚）．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＰｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　６ｏＣ０７　ｍｙ（“℃　射　线对杏鲍菇菌丝的诱变效应）【．『】．Ａｃｔａ　Ｌａｓｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｉｎｉｃａ（激光生物学报），２００４，ｌ３（４）：２９８－３０１．　Ｍｕｎｏｚ　Ｃ，Ｇｕｉｌｌｅｎ　Ｅ　Ｍａ￣ｉｎｅｚ　ＡＴ　ｅｔ　ａ１．Ｌａｃｃａｓｅ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｐｒｏｐｅ￣ｉｅｓ，ａｎｄ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｏｘｙｇｅｎ　ａｎｄ　Ｍｎ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ【Ｊ】ｌ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９９７，６３（６）：２１６６—２１７４．　ＬＩ　Ｇａｎｇ（李刚），ＹＡＮＧ　Ｆａｎ（杨凡），ＬＩ　Ｒｕｉ－ｘｕｅ（李瑞雪）ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｎｅｗ　Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｂｙ　ＵＶ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究）［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ（微生物学报），２００１，４ｌ（２）：２２９．２３３　ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ（张红梅），ＸＵ　Ｓｈｕ－ｘｉａ（徐淑霞），ｗｕ　Ｋｕｎ（吴坤）．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｌａｃｃａｓｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（漆酶产生菌的原生质体诱变选育）【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）（郑州轻工业学院学报＜自然科学版＞），２００５，２Ｏ（２）：１４—１６，２９．