在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素 4－二硝基苯肼法作为第二法。 一、荧光法 1．原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后， 此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 扰。本方法的最小检出限为 0.022 g/ml。 2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3．仪器 3．1．实验室常用设备。 3. 2.荧光分光光度计或具有 3． 3．打碎机。 4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
（ 1）偏磷酸－乙酸液：称取 15g 偏磷酸，加入 40ml 冰乙酸及 250ml 水，搅拌，放置过夜使 之逐渐溶解，加水至 500ml。4C冰箱可保存 7〜10天。
（2）0.15 mol/L 硫酸：取 10ml 硫酸，小心加入水中，再加水稀释至 1200ml。 （ 3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以 0.15mol/L 硫酸液为稀释液，其余同 4.1. 配制。 （4） 50% 乙酸钠溶液：称取 500g乙酸钠（CH3COONS3H2O，加水至1000ml。 （5） 硼酸-乙酸钠溶液：称取 3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4 ）中。临用前配制。 （6） 邻苯二胺溶液：称取 20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至
100ml。
（7） 0 . 04%百里酚蓝指示剂溶液：称取 0.1g 百里酚蓝，加 0.02mol/L 氢氧化钠溶液，在玻 璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为 10.75ml ，磨溶后用水稀释至 250ml。
黄色pH >4.0兰色 变色范围： pH=1.2 红色 pH=2.8
（8） 活性炭的活化：加 200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流 1~2h,过滤，用水洗至滤
液中无铁离子为止，置于 110~120C烘箱中干燥，备用。 （ 9 ）标准
抗坏血酸标准溶液 瓶中，并稀释至刻度。 磷酸
抗坏血酸标准使用液（100卩g/ml ）:取10ml抗坏血酸标准液，用偏
-乙酸溶液稀 1mg/ml）:准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1 ）溶于50ml容量 350nm及430nm波长的荧光计。
OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干
与邻苯二胺（OPDA反应生 C含量的第一标准方法，2、
成具有荧光的喹喔啉 （ quinoxaline ）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正 比，以
释至100ml。定容前试pH值，如其pH> 2.2时，则应用溶液（4.3 ）稀释。
标准曲线的制取下述”标准”溶液（抗坏血酸含量 10卩g/ml ） 0.5、1.0、1.5和2.0ml 标准系列，取双份分别置于 10ml 带盖试管中，再用水补充至 2.0ml 。
5. 操作步骤 5.1 样品制备
全部实验过程应避光。
称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示 剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸 -乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷 酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其 pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。
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当样品液含量在 40~100卩g/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml, 过滤，滤液备用。
5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各 100ml 于带盖三角瓶中，加 2g 活性炭，用 力振摇1mi n,过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准 氧化液，待测定。 5.3 各取 5ml 标准氧化液于 2个 50ml 容量瓶中,分别标明 \"标准\"及\"标准空白 \"。 5.4 各取 5ml 样品氧化液于 2个 50ml 容量瓶中,分别标明 \"样品\"及\"样品空白 \"。
5.5于”标准空白”及\"样品空白”溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动 15min，用水 稀释至50ml，在4 C冰箱中放置2h,取出备用。
5.6于”样品”及”标准”溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至 5.7 荧光反应
取”标准空白”溶液，”样品空白”溶液及(5.6 )中”样品\"溶液各2ml，分别置于10ml带 盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入
5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应 35min,用
激发光波长338nm发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白 荧光强度为纵坐标, 对应的抗坏血酸含量为横坐标, 绘制标准曲线或进行相关计算, 其直线 回归方程供计算时使用。 6.
计算 X=
50ml，备用。
(cx V/m)x FX (100/1000)
mg/100g；
卩g/ml ;
式中： X 样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量, c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度， m --- 试样质量, g； F --- 样品溶液的稀释倍数； V --- 荧光反应所用试样体积,
ml。
例：测定每一制备溶液的荧光强度。 用标准溶液每 ml含2.5卩g、5.0卩g、7.5卩g及10.0卩g, 各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。 由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸( 取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如：取制备好的辣椒样品 2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml
样品读数为 23.34 ，样品空白读数为 3.188，样品读数减去样品空白读数为 20.152 ，查荧光 标准曲线相当标准抗坏血酸的 2.23x100x 50x 100 7.
注意事项
因此, 抗坏血酸的测定应采用新
C。
2.23卩g。
= 52 ( mg/100g) 2.138x 10 x1000
卩g/ml ),按
7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,
鲜样品并尽快用偏磷酸 -醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素
7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤。 7.3 活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用 量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用 中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显。
2g活性炭能使测定样品
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二、 2， 4-二硝基苯肼法 1．原理
总抗坏血酸包括还原型、 脱氢型和二酮古乐糖酸。 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱 氢抗坏血酸，再与 2， 4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比， 进行比色测定。 2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。 3. 仪器
3.1 恒温箱：37 ±）.5 C 3.2 可见 -紫外分光光度计 3.3 打碎机
4．试剂 本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。
4.1 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至 1000ml。 4.2 85%硫酸：谨慎地加 9））ml 硫酸（比重 1.84）于 1））ml 水中。
4.3 2%2， 4-二硝基苯肼溶液：溶解 2g 2， 4-二硝基苯肼于 100ml4.5mol/L 硫酸内，过滤。不 用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。
4.4 2%草酸溶液：溶解 20g草酸于700ml水中，稀释至 1000ml。 4.5 1%草酸溶液：稀释 500ml 2%草酸溶液到 1000ml。 4.6 1%硫脲溶液：溶解 5g 硫脲于 500ml 1% 草酸溶液中。 4.7 2%硫脲溶液：溶解 10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。 4.8 1mol/L 盐酸：取 100ml 盐酸，加入水中，并稀释至 1200ml。
4.9活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至 滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110 C烘箱中烘干。 4.10 标准
（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）:溶解100mg纯抗坏血酸于 100ml 1%草酸溶液中。 （ 2）标准曲线绘制
加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动 1min，过滤。
取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓 度为20卩g/m。
取 5， 10， 20， 25， 40， 50， 60ml 稀释液，分别放入 7 个 100ml 容量瓶中，用 1%硫脲溶液 稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为 按样品测定步骤形成脎并比色。 以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（ 5. 操作步骤
5.1 样品制备 全部实验过程应避光。
5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取 （含 1-2mg 抗坏血酸）倒入 100ml 容量瓶中,用 1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。 5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入 浆,倒入 100ml 容量瓶中,用 1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。
5.1.3将上述两液过滤,滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后,倾出上清液,过滤, 备用。 5.2氧化处理：取25ml上述滤液，加入 0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤
1%草酸溶液磨成匀
10-40g匀浆
卩g/m）为横坐标绘制标准曲线。
1 , 2, 4, 5, 8, 10及12卩g/m。
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液。取 10ml 此氧化提取液，加入 10ml 2%硫脲溶液，混匀。 5.3 呈色反应
5.3.1 于三个试管中各加入 4ml 稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入 1.0ml 2%2 ， 4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入
37 ±.5 C恒温箱或水浴中，保温
3h。
5.3.2 3h 后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后 加入 1.0ml 2%2， 4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置 样品。
5.3.3 85%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入 要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置 5.3.4比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于 6. 计算 同荧光法。 7. 注意事项
7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新 鲜样品并尽快用 2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素 C。 7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。 7.3 试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后 VC 测定
1. 原理：在有硫酸、偏磷酸存在的条件下，钼酸铵和
V C 反应生成蓝色络合物。在一定浓度
(2-32ug/ml )内服从比耳定律。并且不受提取液中还原糖及其它物质干扰。专一性好，反 应迅速，但 T 对比色有影响，且颜色深度随时间延长而加深，因此 显色、温度和放置时间 要求一致 。 2. 仪器：磁力搅拌器 离心机 分光光度计 天平 研钵 3 个 100ml 具塞三角瓶 3个 50ml 量筒 1 个 100ml 离心管 3个 25ml 具塞刻度 9支 100ml 容量瓶 2个 移液管： 0.5ml 1 支 1ml5 支 2ml 1 支 3. 试剂：
① 5%钼酸铵水溶液
② 草酸(0.05mol/L)-EDTA(0.2mol/L)溶液：6.3g 草酸和 0.75g EDTA-Na2,用蒸馏水定 容到 1L ③ H2SO4(1:19)
④ 偏磷酸乙酸溶液：偏磷酸 3g加(1 : 5)冰乙酸40ml.溶解后，加水稀释至 100ml.必要
时过滤，此试剂在冰箱中可保存 3天，最好现用现配
⑤ 标准Vc溶液：100mgVc加适量草酸-EDTA溶解，并定容于100ml容量瓶，摇匀, 此液为
1mg/mlV c,现用现配
4. 步骤 4． 1 标准曲线制作： 标准Vc溶液(ml) 草酸-EDTA ( ml) 偏磷酸 —乙酸( ml) H2SO4(1:19) 蒸馏水 (ml)
( ml)
2 16.5
760nm 下比色,绘标准曲线。
100ml 具塞三角瓶中,加
钼酸铵溶液 (ml)
5 0.5
1
摇匀
0 4.9
0.1
4.8
0.2
4.6
0.4
4.4
0.6
4.2
0.8
30分钟应准时比色。 5ml85%硫酸，滴加时间至少需
30min后比色。
10~15min 后放入冰水内。其余步骤同
500nm波长测吸光值。
摇匀，于30C水浴中放置15min.以零管调零点,
4.2 取 5-10g 样品 于研钵中,加 少量草酸 -EDTA 研磨至匀浆,置
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50ml草酸-EDTA （计研磨时加入量），于磁力搅拌器上 搅拌20min,放置0.5h•倒入100ml离 心管中，以4000 r/min离心15min .取上清液1-5ml （视 V 含量定）于大试管中，（3个具塞 三角瓶、3个研钵，3个100ml离心管，3个试管） 草酸-EDTA （ ml） 偏磷酸一乙酸（ml） H2SO4（1：19） ）
钼酸铵溶液（ml）
（ml
5 0.5 1 摇匀 2 16.5
1支5ml移液管、1支20ml移液管）
（若加钼酸铵后溶液浑浊， 待显色15min后，再以4000 r/min离心20min ,倾取上清液760nm
比色
VC含量（mg/100g） =100 x C x V /W x VM=333.33 C
C—由回归方程算出的 Vc含量 VT—提取液体积（ml） W —样品重（ml） 2.5 VM —测定液体积（ml） 3
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